Thema:

Expertenpanel

Next-Generation-Sequencing

Kompakte Desktop-Sequencer sind mittlerweile für jedes Labor erschwinglich geworden.  Mitte September haben sich die Preise für ein Endgerät auf 40.000 bis 60.000 Euro halbiert. Damit werden nicht länger nur die wenigen hundert großen Zentren für Genomsequenzierung bedient, sondern die schnelle Sequenzierung dringt in den Forschungsmarkt und das Gesundheitswesen vor. Was die Systeme leisten, was Dienstleister anbieten und wo Zukunftsanwendungen liegen, erklären Spezialisten aus Industrie und Academia in der neuen Rubrik Expertenpanel.

Dag Harmsen

LABORWELT:

Wie können Benchtop-Next-Generation-Sequenzer zu einer genombasierten Diagnose und Überwachung von Epidemien beitragen?

Harmsen:

Die Karten auf dem Markt für Next-Generation-Sequenzer (NGS) werden gerade neu gemischt. War NGS seit den Anfängen im Jahr 2005 eine Angelegenheit von weltweit wenigen hundert Genom-Sequenzierzentren, so öffnet sich gerade durch Einführung von erschwinglichen Benchtop-NGS-Geräten ein riesiger neuer Markt. Jedes Krankenhauslabor wird zum potentiellen Kunden - es tritt quasi gerade eine "Demokratisierung" von NGS ein. Benchtop-NGS-Geräte, wie die Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) oder in Kürze der Illumina MiSeq, sind jedoch nicht nur günstig in der Anschaffung, sondern skalierbar im Einsatz und insbesondere sehr schnell, das heißt von der DNA zur Sequenz in ein bis zwei Tagen. Damit eignen sie sich hervorragend für den Routineeinsatz in der Mikrobiologie, Onkologie, Humangenetik oder Transfusionsmedizin. Gerade beim Einsatz im Rahmen von mikrobiellen Ausbruchsgeschehen ist Geschwindigkeit natürlich Trumpf. Der Einsatz von NGS steht damit gerade am Wendepunkt von der Grundlagen- hin zur angewandten Forschung und Routinediagnostik. Dies konnte wir an der Universität Münster (WWU) gerade beim Management von EHEC in Deutschland und Klebsiella OXA-48 in den Niederlanden exemplarisch für die Bakteriologie demonstrieren. Dies dürfte den Beginn der prospektiven genomischen Epidemiologie markieren. Hierbei werden klassische epidemiologische Überwachungsparameter (Ort, Zeit und Person) mit genomweiten NGS-Typisierungsergebnissen für spezifischere Frühwarnsysteme kombiniert. In letzter Konsequenz könnten beispielsweise auch Abwässer mit NGS für eine "Krankheiten-Wetterkarte" überwacht werden, um durch die Kenntnis von der Verbreitung von Erregern in der Umwelt noch vor dem Auftreten von Ausbrüchen geeignete Präventionsmaßnahmen ergreifen zu können.

Dag Harmsen leitet die Forschungsabteilung an der Poliklinik für Parodontologie der Universität Münster. Seine Arbeitsgruppe erlangte weltweite Anerkennung durch Arbeiten zur angewandten Bioinformatik in der Mikrobiologie und baute weltweit die größte öffentlich molekulare Typisierungsdatenbank auf.  

Marcel de Leeuw

LABORWELT:

Welche Vorteile bietet die Nutzung von NGS-Dienstleistungen auf mehreren Technologieplattformen gegenüber einem eigenen Gerät?

De Leeuw:

Sämtliche Next-Generation-Sequencing-Technologien haben ihre Stärken und Schwächen. Keine der aktuellen Plattformen ist imstande, komplette Coverage auch nur für ein moderat komplexes mikrobielles Genom zu liefern – typischerweise werden kurze Stränge mit hohem GC-Anteil nicht abgedeckt. Dazu kommt, dass es für das Programme schwierig ist, Teile des Genoms richtig zu asssemblieren, zum Beispiel die multiplen Kopien der ribosomalen Operons in mikrobiellen Genomen. Bei den Genomen höherer Organismen, wie etwa Säugern oder Pflanzen, brechen Regionen “niedriger Komplexität” die Assemblierung in viele Contigs auf.

Die kombinierte Nutzung multipler Plattformen kann die Qualität der Resultate wesentlich verbessern. Ein Beispiel ist die “hybride” Assemblierung unter kombinierter Nutzung der Roche/454- und Illumina-Plattform – also entweder durch den Einsatz beider Auslesearten nacheinander oder durch stufenweise Bearbeitung. Die Roche/454-Reads liefern mittlere und lange Leseweiten und nutzen normalerweise eine 3 kb mate-pair-Bibliothek. Die Illumina-Reads bieten eine hohe lokale Sequenzqualität und in schlecht abgedeckten Sequenzbereichen, in denen beide Technologien Schwierigkeiten haben, eine ergänzende Sequenzabdeckung. Da es in der Regel nicht rentabel ist, mehrere Next-Gen-Plattformen für den Eigenbedarf zu implementieren, bietet es sich an, die Vorteile der Kombination von mehreren Next-Gen-Plattformen bei einem Dienstleister zu nutzen. Beckman Coulter Genomics setzt diesen hybriden Ansatz seit über einem Jahr routinemäßig ein, der so de facto zum Gold-Standard für die publikationsfertige Sequenzierung geworden ist. Dieser kombinierte Ansatz reduziert die Notwendigkeit des Finishings genomischer Regionen niedriger Qualität mit der Sanger-Methode. Kombiniert mit der automatischen Präparation der Sequenzbibliothek vor der Sequenzierung und der bioinformatischen Auswertung danach, ermöglicht dieses Vorgehen eine sehr kosteneffiziente und schnelle genomische Sequenzierung.

Marcel de Leeuw ist Staff Bioinformatics Scientist bei Beckman Coulter Genomics in Grenoble. Der Dr. der Informatik arbeitet seit 12 Jahren in der Genomforschung. Nach Tätigkeiten als Head of IT bei Genome Express und als Global Business Leader bei Cogenics wechselte er zu Beckmann Coulter Genomics in Grenoble.

Thomas Jarvie

LABORWELT:

Kürzlich berichtete Roche über eine weitere Verlängerung der Leseweiten ihrer Next-Generation-Sequenziersysteme. Welche Vorteile ergeben sich dadurch gegenüber anderen Sequenzern am Markt?

Jarvie:

Der Vorteil der langen Leseweite der 454-Systeme GS FLX+ und GS Junior ist ihre Fähigkeit; komplexe biologische Vorgänge aufzuklären. Anders als kurze Reads (von 50 bis 100 Nukleotiden) helfen lange Leseweiten (von 500 bis 750 Basen), weit voneinander entfernte Genvariationen funktionell miteinander zu verknüpfen und Sequenzen zu unterscheiden, die über weite Distanzen identische Sequenzen aufweisen. Das ist bei einer Reihe von Anwendungen wichtig. Beim Transkriptom-Sequencing decken lange Leseweiten mehrere Exons ab und geben eindeutig Auskunft darüber, dass diese zum selben Transkript gehören. Bei der de novo-Sequenzierung von Organismen erhält man so einen besseren Überblick über die Vollängengene beziehungsweise Transkripte. In Organismen, die ein einzelnes Gen in multiplen Isoformen exprimieren, sind lange Reads entscheidend, um die Expression der verschiedenen Isoformen aufzuklären. Denn um die zahlreichen Exonunterbrechungen zu überspannen, muss die Leseweite lang genug sein.

In jüngeren Mikrobiomstudien wurden komplexe mikrobielle Gemeinschaften anhand der Sequenzierung ihrer 16S-rRNA in verschiedenen ökologischen Nischen untersucht. Hier ist das 454-Sequencing bereits zum de facto-Standard geworden und ermöglicht die Klassifizierung der Mikroorganismengemeinschaften bis auf Gattungs- oder Artebene. Next-Generation-Sequenzer, die kurze Leseweiten liefern, sind bei der Klassifikation deutlich gröber und klassifizieren nur bis zur Stammesebene. Eine korrekte Assemblierung der Sequenz großer komplexer Genome, zum Beispiel von Pflanzen oder Tieren, ist aufgrund der darin enthaltenen zahlreichen Repeats nur mit langen Leseweiten möglich, die die Repeats überspannen. Auch die in komplexen Genomen auftretenden Pseudogene und Familien nahe verwandter Gene können mit den langen und sehr genauen Reads unterschieden werden. Zusammengefasst sind das GS FLX+ und das GS Junior System sehr leistungsfähige Werkzeuge für die de novo-Sequenzierung und die Assemblierung jeder Genomgröße.

Ein letztes Beispiel ist die gezielte Sequenzierung hochvariabler Regionen, wie etwa in Virusgenomen oder den HLA-Genen. In Viren, wie etwa HIV, ist das Genom ist in bestimmten Loci so variabel, dass lange Leseweiten erforderlich sind, um die hochvariablen Teile zu überbrücken und die stabileren Teile zu verbinden. Auch die HLA-Region ist so hochvariabel, dass es erforderlich ist, die multiplen Variationen mittels einer langen Leseweite eindeutig miteinander zu verbinden und so den individuellen HLA-Typ zu bestimmen. Das GS Junior System ist ein ideales Werkzeug, um gezielt interessierende genomische Bereiche über Target-Anreicherungstechnologien oder Multiplex-Amplicons zu sequenzieren. 

Thomas Jarvie ist als internationaler Produktmanager bei 454 Life Sciences an der Entwicklung der 454 Hardware, Reagenzien, Kits und Software beteiligt. Im Anschluss an seine Postdoc-Zeit arbeitete der Biophysiker von 1995 bis 2002 für Curagen, bevor er in der High-troughput Sequencing Facility und ab 2005 als Technical Product Manager in der Applikationsentwicklung für das 454-Sequencing tätig war. 

Bernd Timmermann    

LABORWELT:

Worin liegen für die Nutzer von Desktop-NGS derzeit die Hauptpro­bleme und Kostenfallen?

Timmermann:

Um auch kleinere Labore adressieren zu können, brachte Roche im März 2010 den GS Junior auf den Markt. Dieser produziert ca. 100.000 Reads mit einer Leselänge von ca. 400 Basen und zeichnet sich durch seine Schnelligkeit und Stabilität aus. Der Ion PGM Sequencer von Ion Torrent, der die gleiche Zielgruppe hat, kämpft derzeit mit noch sehr unzureichenden Leselängen (momentan ca. 160 Basen) und vor allem mit der noch ungenügenden Genauigkeit des Basecallings. Der Dritte im Bunde wird der MiSeq von Illumina sein. Gegenwärtig werden hier die ersten Geräte in Europa ausgeliefert. Er basiert auf der etablierten Illumina-Technologie und soll mittels paired end-Sequenzierung (2 x 150 Basen) einen Duchsatz von 1 GB erreichen.

Während noch vor kurzem die NGS-Datenauswertung als Hauptproblem galt, zeigt sich nun, dass eher die Probenvorbereitung oft unterschätzt wird. Zur Hauptnutzergruppe des GS Junior gehören bereits heute die diagnostischen Labore. Hier dürfte eine der wichtigsten Applikationen die Amplicon-Sequenzierung, z.B. zur Analyse ausgewählter Kandidatengene sein. Aber bereits bei den 100.000 Reads des Gerätes stellt sich die Frage der Äquimolarität der eingesetzten Produkte – alle PCR-Produkte müssen mit der gleichen Anzahl eingesetzt werden, um am Ende auch eine gleichmäßige Verteilung der resultierenden Reads zu gewährleisten. Diese Fragestellung ist sicher lösbar, erfordert jedoch einen gewissen Automatisierungsgrad, also auch zusätzliche Investitionen. So scheint z.B. das Fluidigm Access Array System eine sehr gute Lösung in Kombination mit dem GS Junior.Generell ist allen potentiellen Nutzern von NGS Desktop-Geräten zu empfehlen, sich den gesamten Weg der Datenproduktion von PCR/ Library-Präparation, den jeweiligen monoklonalen Amplifikationsschritt, die Sequenzierung über die Datenauswertung – mit Blick auf die Praktikabilität im individuellen Laborsetting genau anzuschauen.

Bernd Timmermann leitet seit Ende 2007 die Next-Generation Sequencing-Gruppe, seit 2010 die Max-Planck Core Sequencing Facility am Berliner MPI für molekulare Genetik (MPIMG). Nach Promotion in Molekularbiologie an der Charité leitete er die DNA-Sequenzierung der Genprofile AG. Seit 2002 ist er leitender Wissenschaftler am MPIMG. Kontakt: timmerma@molgen.mpg.de

Mehr zum Spezial

Magazin zum Thema


Heft 5/2011

© 2007-2017 BIOCOM

http://www.laborwelt.de/spezialthemen/zelltechnologie/next-generation-sequencing.html

Alle Themen

SpezialThemen

Produkt der Woche

Alle Produkte

Kalender

Alle Events

Partner-Events

Glasgow (UK)

DIA BioVenture Day

Istanbul (TR)

expomed eurasia