Thema:

Zellsortierung

Einzelzellmessung mechanischer Eigenschaften

Markierungsfreie Methoden zur Identifikation einzelner Zellen in komplexen Gemischen werden vielerorts diskutiert. Besonders günstig ist es für zahlreiche Anwendungen, wenn die Untersuchung zusätzlich zerstörungsfrei abläuft, die Zellen also nicht beispielsweise lysiert werden müssen, um an Inhaltsstoffe zu gelangen, sondern nachträglich noch intakt zur Verfügung stehen. Als Sortierungskriterium bietet sich die Auswertung der mechanischen Eigenschaften der Zellen an, die dank neuer Entwicklungen mit sehr geringem Aufwand schnell und automatisierbar vermessen werden können.

Hierbei werden externe Kräfte an die einzelnen Zellen angelegt. Aus der resultierenden Verformung werden Rückschlüsse auf ihre viskoelastischen Parameter gezogen. Dieser Artikel stellt ein Zell-Stretcher-Verfahren vor, das besonders einfach in mikrofluidische Kanäle integriert werden kann. Wir zeigen Anwendungsfelder auf und diskutieren mögliche Probleme.

Zellen werden in einem Gemisch verschiedener Zelltypen - wie sie in einer Patientenprobe auftreten - anhand spezifischer Biomarker identifiziert. Als Biomarker kann zum Beispiel die Expression bestimmter Membranproteine dienen, die durch fluoreszente Liganden oder Antikörper markiert werden können, oder etwa der Nachweis charakteristischer Nukleinsäuresequenzen. Soll die Zellidentifikation diagnostischen Zwecken dienen, muss beim Nachweis berücksichtigt werden, dass im medizinischen Umfeld ein geringstmöglicher Vorbereitungsaufwand und ein rasches Mess-ergebnis wichtig sind.

Zellmechanik als Biomarker

Vor diesem Hintergrund bieten sich Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften verschiedener Zellen als Biomarker an. Sie ermöglichen eine Zellanalyse ohne vorherige Färbeprozeduren und potentielle Artefakte durch hinzugefügte Reagenzien (labels). Die im akademischen Bereich gebräuchlichste Technik zur Bestimmung der mechanischen Parameter lebender Zellen ist die Nanoindentation mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM)1. Die Erweiterung um frequenzmodulierte Belastungen erlaubt darüber hinaus auch die Messung viskoelastischer Eigenschaften2. Ungewöhnlichere Verfahren umfassen etwa die Beobachtung einer magnetisch induzierten Verschiebung von Partikeln, die an adhärente Zellen gekoppelt wurden3. Einen wesentlichen Fortschritt der mechanischen Zellcharakterisierung stellte die Nutzung optischer Kräfte für die kontrollierte Verformung einzelner Zellen dar, aufgrund derer sich beispielsweise Zellen zweier unterschiedlich aggressiver Neoplasien unterscheiden ließen4. Dieser "optische Stretcher" wurde in eine Durchflussmesszelle eingebaut, um seriell eine größere Anzahl von Zellen auswerten zu können. Nachfolgende Arbeiten zielten auf einen quantitativen Vergleich der Optischen-Stretcher-Technologie mit der etablierten AFM-Technik ab5.

Diesem Ansatz ähnelt physikalisch die Verwendung elektrischer statt optischer Kräfte, um lebende Zellen mechanisch zu verformen und daraus charakteristische Materialeigenschaften zu bestimmen. Die absolute Größe der ausgeübten Kräfte ist in beiden Fällen annähernd gleich. Der elektrische Stretcher weist jedoch eine Reihe weiterer Vorteile gegenüber den optischen Aufbauten auf: Die Notwendigkeit einer Laser-Quelle entfällt, ebenso wie die der genauen Justage zweier Glasfasern. Die Integration nahezu beliebig großer und geformter Mikroelektroden in Mikrofluidiken ist aufgrund langjähriger Entwicklung in diesem Gebiet6 deutlich einfacher zu bewerkstelligen als die von Glasfasern. All dies schlägt sich nicht zuletzt im Preis eines zu konstruierenden Gerätes nieder.

Der erste Bericht eines dedizierten elektrischen Stretchers stammt aus der Zeit vor dem routinemäßigen Einsatz der Photolithographie, als Mikroelektroden noch aus Rasierklingen angefertigt wurden. Zwar erbrachten diese Aufbauten wertvolle Daten, doch blieb ihr Einsatz meist auf grundlagenwissenschaftliche Fragestellungen zu den mechanischen Eigenschaften beispielsweise von Lipidmembranen beschränkt8 - mit begrenzter medizinischer Relevanz. Erst in jüngster Zeit erfolgte die diagnostisch hochinteressante Nutzung der Zelldehnung als Biomarker mit den einfachen und kostengünstigen elektrischen Aufbauten.

Der elektrische Stretcher

Das physikalische Grundprinzip des elektrischen Stretchers ist leicht verständlich: Die einzelne zu untersuchende Zelle wird in das elektrische Feld zwischen zwei Mikroelektroden gebracht. Infolgedessen kommt es - bei geeigneter Wahl der experimentellen Parameter - innerhalb der Zelle zur Umorientierung von Molekülen mit Dipolcharakter oder auch zur Verschiebung der Gegenionen um fixe Ladungen herum. All diese Effekte werden zusammengefasst als die Ausbildung von Polarisationsladungen in der Zelle bezeichnet (Abb. 1). Im Ergebnis befinden sich effektiv elektrische Ladungen in einem äußeren elektrischen Feld. Gemäß den bekannten Gesetzen der Physik resultiert daraus eine wirkende Kraft. Diese zieht die Ladungen zu den Elektroden, wobei sie die Zelle entsprechend ihrer begrenzten Verformbarkeit dehnen. Die vorher sphärische Zelle ist daher nun ellipsoid. Die Deformation wird mit einfachen bildgebenden Verfahren als strain ε gemessen. Um schädliche Effekte auf die Zelle zu minimieren, wie etwa die räumliche Bewegung geladener Moleküle in der Zelle oder ihrer Membran, wird üblicherweise kein zeitlich konstantes elektrisches Feld angelegt, sondern ein schnelles Wechselfeld im Kurzwellenbereich. Dies ändert jedoch nichts am zugrundeliegenden Prozess.

Die technische Umsetzung dieses Prinzips zeigt ebenfalls die Abbildung 1: Zum Zwecke der Identifikation der Zellen über das Ausmaß ihrer elektrisch induzierten Dehnung werden zwei Mikroelektroden an geeigneter Stelle in einen Mikrokanal integriert. Dabei können sich die Elektroden je nach dem gewählten Herstellungsverfahren zum Beispiel in den Seitenwänden des Kanals befinden oder - wie hier gezeigt - auf dem Boden oder der Decke aufgebracht sein. Für die meisten untersuchten humanen Zellen erwies sich ein Abstand von 20 µm als optimal. Die elektrische Feldstärke beträgt dann 300 kV/m. Um die identifizierten Zellen beispielsweise entsprechend ihrer Eigenschaften sortieren zu können, weisen diese Chips üblicherweise stromabwärts des elektrischen Stretchers eine Verzweigung in mehrere fluidische Ausgänge auf. Weitere Manipulationselektroden dienen dazu, die Zellen in einen davon zu führen. Das ganze Verfahren lässt sich im Sinne einer Geräteentwicklung weitgehend automatisieren. Dazu gehören unter anderem die Steuerung des Generators, eine rechnergestützte Bildanalyse zur Auswertung der Zelldehnung sowie das Schalten der Ventile und der Pumpe, die den Transport der Zellsuspension kontrollieren.

Einige beispielhafte Ergebnisse

Ein typisches Ergebnis veranschaulicht die Abbildung 2: Die Dehnung der Zellen entlang der elektrischen Feldlinien im Spalt zwischen den Elektroden ist hier deutlich zu erkennen. Da Zellen nicht nur elastisch, sondern viskoelastisch sind, ist dieser Prozess auch zeitabhängig. Trägt man die gemessene Dehnung ε gegen die Zeit auf, so werden Unterschiede im Verhalten verschiedener Zellen offensichtlich. Zum anderen liefern diese Kurven Informationen darüber, wie lange nach dem Einschalten der Spannung gewartet werden muss, bevor zwei gegebene Zelltypen sicher voneinander unterschieden werden können. Diese Zeitspanne beträgt in der Regel ungefähr zehn Sekunden. Als Resultat erhält man Dehnungsdiagramme wie das in der Abbildung 2 gezeigte. In diesem Beispiel wurden Zellen desselben Typs (Fibroblasten) aus dem gleichen Organismus (Maus) verglichen. Bereits bei einander derart nahe verwandten Zellen sind deutliche Unterschiede messbar. Analoge Untersuchungen erfolgten auch für humane Brustkrebszellen (MCF-7) und nichtentartete Zellen aus dem gleichen Gewebe (MCF-10)4. Bei diesen erwies sich das Mikrotubuligerüst als maßgeblich für ihr Dehnungsverhalten. Eine weitere Anwendung des elektrischen Stretchers fokussierte sich auf die Identifikation von Faktoren, die für die Änderung der zellulären mechanischen Eigenschaften im Verlauf der Kultivierung verantwortlich sind.

Eine berechtigte Frage, die jede Manipulation lebender Zellen aufwirft, ist die nach der hervorgerufenen Schädigung. Dies betrifft natürlich auch die Stretcher. Während es für den optischen Bereich - nicht zuletzt, seitdem Laser-Pinzetten weite Verbreitung gefunden haben - umfangreiche Literatur über photoinduzierte Zellschädigungen gibt, sind bei elektrischen Feldern im Hochfrequenzbereich nach heutigem Wissensstand Schäden stets thermisch bedingt. Der Strom, der durch das die Zellen umgebende Medium fließt, erzeugt gemäß dem Ohmschen Gesetz Wärme. Dieser Vorgang ist klar physikalisch beschreibbar und beispielsweise mittels Infrarotthermographie quantifizierbar. Im Ergebnis erhält man für die hier vorgestellten elektrischen Stretcher die in der Abbildung 2 gezeigte 37 °C-Isotherme in Abhängigkeit von den beiden experimentell einstellbaren Parametern elektrische Spannung U und elektrische Leitfähigkeit σ. Wählt man einen der beiden Parameter (oder beide) hinreichend niedrig, so überschreitet die Temperatur in der Messkammer nicht die als zellunschädlich angenommenen 37 °C und andersherum. Die blauen Geraden zeigen an, dass etwa bei einer elektrischen Spannung von 6 V eine elektrische Leitfähigkeit von maximal 250 mS/m verwendet werden dürfte. Tatsächlich kam jedoch in sämtlichen genannten Arbeiten eine 50-fach niedrigere Leitfähigkeit zum Einsatz. Die dazugehörige Gerade ist in der Abbildung 2 grün markiert und in dieser Darstellung von der Abszisse kaum noch zu unterscheiden. Eine nennenswerte Erwärmung ist in diesem Bereich ausgeschlossen. Die kritische Spannung zum Erreichen von 37 °C würde dort 40 V betragen - ein etwas "pathologischer" Wert.

Wie wird es weitergehen?

Der wichtigste Schritt auf dem Weg in die Anwendung ist die Überführung eines als wertvoll erkannten Prinzips in ein nutzbares Gerät. Entsprechende Tätigkeiten sind derzeit in Zusammenarbeit mit der ETH Lausanne im Gange. Der wesentliche Vorteil der Methodik ist dabei - neben dem einfachen Messaufbau und dem Entfallen aufwendiger Probenvorbereitungsschritte - die geringe erforderliche Materialmenge. Dies ermöglicht besonders patientenschonende Verfahren, wie die Feinnadelbiopsie. Eine beispielhafte Anwendung in dieser Hinsicht ist die Selektion mesenchymaler Stammzellen aus Gelenkproben.

Eine biologische Fragestellung für zukünftige Untersuchungen wird sich darauf fokussieren, den Zusammenhang des Biomarkers "Biomechanik" mit den Intermediärfilamenten des Zytoskeletts weiter aufzuklären. Seit Ende der 80er Jahre ist die Korrelation zwischen der Vimentinexpression und dem Metastasierungsgrad von Brustkrebs bekannt11. Hier arbeiten die Stretcher um Größenordnungen schneller als jede biochemische Expressionsanalyse.

Literatur

[1] Rotsch, C., Radmacher, M. Biophys J 78 (2000), 520-535.
[2] Mahaffy, R.E., Park, S., Gerde, E., Käs, J., Shih, C.K., Biophys J 86 (2004), 1777-1793.
[3] Lenormand, G., Millet, E., Fabry, B., Butler, J.P., Fredberg, J.J., J R Soc Interface 1 (2004), 91-97.
[4] Guck, J., Schinkinger, S., Lincoln, B., Wottawah, F., Ebert, S., Romeyke, M., Lenz, D., Erickson, H.M., Ananthakrishnan, R., Mitchell, D., Käs, J., Ulvick, S., Bilby, C., Biophys J 88 (2005), 3689-3698.
[5] Wottawah, F., Schinkinger, S., Lincoln, B., Ebert, S., Müller, K., Sauer, F., Travis, K., Guck, J., Acta Biomater 1 (2005), 263-271.
[6] Fuhr, G., Glasser, H., Müller, T., Schnelle, T., BBA 1201 (1994), 353-360.
[7] Engelhardt, H., Sackmann, E., Biophys J 54 (1988), 495-508.
[8] Thom, F., Gollek, H., J Electrostat 64 (2006), 53-61.
[9] Guido, I., Jaeger, M.S., Duschl, C., Eur Biophys J 40 (2011), 281-288.
[10] Guido, I., Jaeger, M.S., Duschl, C., Cytotechnology 62 (2010), 257-263.
[11] Fritsch, A., Höckel, M., Kiessling, T., Nnetu, K.D., Wetzel, F., Zink, M., Käs, J.A., Nat Phys 6 (2010), 730-732.


Korrespondenzadresse:
Dr. Magnus Jäger
Tel.: +49-(0)-331-58187-305
Fax: +49-(0)-331-58187-399
magnus.jaeger@ibmt.fraunhofer.de

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