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Blitzlicht

Depletion von T-Zellen aus peripheren Stammzellen

Die allogene Stammzelltransplantation gewinnt eine neue Qualität. Grund dafür ist der Diagnostikgewinn durch die moderne Durchflusszytometrie, die eine gezieltere Auswahl der Zellen des Transplantats erlaubt. Bei der allogenen Stammzelltransplantation müssen wir die Schwierigkeit bewältigen, Spender mit immunologisch passendem HLA-Profil zu finden oder die verfügbaren Transplantate für eine erfolgversprechende Transplantation so zu manipulieren, dass Komplikationen wie die Graft versus Host Disease (GvHD) gemildert werden.

Die im folgenden dargestellte Studie soll dazu beitragen, hierfür bessere Lösungen zu finden. Forschungsziel war es, eine Methode für die klinische, großmaßstäbliche Depletion von αβ-T-Lymphozyten aus mobilisierten peripheren Stammzellen zu entwickeln und so allogene Transplantate zu erhalten, die mit Stammzellen, Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und γδ-T-Lymphozyten angereichert sind.

Gängiges Verfahren bei der Stammzelltransplantation ist die T-Zelldepletion mit Hilfe von Antikörpern, die gegen T-Zell-Oberflächenantigene gerichtet sind. Derzeit ist hierfür die Positivselektion von Stammzellen mit dem CD34-Marker eine weitverbreitete Methode. Die Transplantation dieser Zellen kann allerdings lebensbedrohliche Virus- und Pilzinfektionen sowie Leukämierückfälle begünstigen. Denn die Positivselektion von CD34+-Stammzellen führt zwar zu einer ausgezeichneten T-Zelldepletion, entfernt aber andere, immunologisch nützliche Zellen, insbesondere Natürliche Killerzellen (NK-Zellen).

Die im folgenden beschriebenen Untersuchungen dienen der Entwicklung eines optimierten Depletionsverfahrens, das den Kreis der möglichen Spender und Zellquellen erweitert und darüber hinaus durch bessere Selektion mehr hilfreiche Zellarten im Transplantat belässt.

Mobilisierung und Gewinnung von peripheren Blutstammzellen

Hierfür haben wir sieben Großversuche durchgeführt. Im ersten Arm wurden "nicht-mobilisierte" periphere Blutstammzellen (PBSCs) mittels Leukapherese aus drei gesunden erwachsenen Freiwilligen gewonnen, im zweiten Arm aus vier "mobilisierten", gesunden, freiwilligen erwachsenen Spendern nach täglicher subkutaner Injektion von G-CSF (10 µg pro kg Körpergewicht, bei einer Maximaldosis von 480 µg/pro Tag; Neupogen; Amgen, Thousand Oaks, CA, USA) für vier Tage. Eine Leukapherese wurde am fünften Tag unter Anwendung eines Cobra Spectra Cell Separators (Cobe, Lakewood, CO, USA) durchgeführt.

Depletion von αβ-T-Zellen

PBSC wurden mit der gleichen Menge autologen Plasmas vermischt und über Nacht bei 4°C gelagert. Dann wurden diese Zellen (7 x 109 Gesamtzellzahl) einmal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen (PBS unter Zusatz von 1 mM EDTA) und mit 1 ml Biotin-konjugiertem (BMA031-biotin; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) anti-αβ-Antikörper für 30 Min. bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 7,5 mL anti-Biotin an magnetische Micro-Beads (Miltenyi Biotec) gekoppelt. Unter ständigem Schütteln wurden die an die Beads konjugierten Zellen bei Zimmertemperatur für 30 Min. inkubiert, zweimal mit CliniMACS-Pufferlösung gewaschen (Miltenyi Biotec, Auburn, CA USA) in 300 mL Pufferlösung resuspendiert. Zum Schluss haben wir sie im automatisierten CliniMACS-Gerät (Miltenyi Biotec) mit LS/TS (162.01)-Trennsäulen unter Verwendung des Programms Depletion 2.1 entsprechend Herstelleranweisungen aufgetrennt.

Durchflusszytometrische Analyse

Vor und nach der αβ-T-Zelldepletion haben wir das Auftreten der Oberflächenmarker CD3, CD14, CD19, CD20, CD56, CD133, CD34 und der T-Zellrezeptoren αβ und γδ untersucht. Eingesetzt wurde hierzu ein LSR-Durchflusszytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) . Mit folgender Methode haben wir das Produkt auf verbliebene T-Zellrezeptor-αβ-Zellen geprüft: Eine Mischung der an den αβ-T-Zellrezeptor gekoppelten Farbstoffe Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) (BMA 031; Caltag Laboratories, Burlingame, CA USA) und Phycoerythrin (11F2; BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA), an den CD45-Rezeptor gekoppeltes PE-TR (J33; Coulter/ Immuntech Co., Miami, FL, USA), an den CD3-Rezeptor konjugiertes APC (SK7; BD Biosciences Pharmingen) sowie an CD14 gebundendes APC-CY7 (MoP9; BD Biosciences Pharmingen) wurde in 5-ml Prüfröhrchen gegeben. Nach Zugabe von etwa 106 Zellen in jedes Prüfröhrchen inkubierten wir diese für 10 Min. bei Zimmertemperatur im Dunkeln. Dann wurden verbliebene Erythrozyten (RBK) mit 3 mL Ammoniumchloridlösung lysiert, zentrifugiert und einmal mit färbender Pufferlösung (Dulbecco's PBS, enthält 1% hitzeinaktiviertes FKS) und 0,01% NaN3, behandelt. Zur Unterscheidung abgestorbener Zellen wurden 50 µl einer auf eine Konzentration von 1 µg/ml eingestellten DAPI (4′,6-Diamidin-2-Phenylindol, Dihydrochlorid, Molekularproben, Eugene, OR, USA)-Lösung hinzugefügt.

Gesammelt haben wir die Datensätze mittels eines BD LSR II (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), der mit drei Lasern ausgestattet ist. Die Ergebnisse der Prüfröhrchen - jedes mit 1x105 bis 1x106 Frischzellen - wurden mittels BD FACS Diva-Software (Becton Dickinson) analysiert. Da die gleichen Antikörper zur Depletion (Clone BMA031) und zur Erkennung von αβ-T-Zellen nach Depletion verwendet wurden, haben wir weitere anti-αβ-Antikörper (Clone WT31; Becton-Dickinson) zur Erkennung der nach der Depletion verbleibenden T-Zellen eingesetzt.

Funktionelle in vivo- und in vitro-Experimente

Kolonieexperimente: Nach der Depletion haben wir die in vitro-Funktionalität der Stammzellen mittels Kolonieexperimenten geprüft. Somit konnten wir die Anteile an CD133+ in den Zellen vor der Depletion und im depletierten Produkt bestimmen. Sie wurden auf dieselbe Anzahl von CD133+ angepasst. Des weiteren isolierten wir CD133+-Stammzellen aus den mononukleären Zellen (mononuclear cells, MNC) vor Depletion mittels des CD133-Selektionssatzes (Selectin Kit, Miltenyl Biotec) und AutoMacs (Miltenyl Biotec). Die Zellen wurden in einer Konzentration mit dem Äquivalent von 1.000 CD133+ pro Platte in einem Methylcellulose-basierten, halbfesten Kulturmedium (Methocult H4433; Stem Cell Technologies Vancouver, Canada) ausplattiert. NAch 14 Tagen konnten die Kolonien ausgezählt und die Anwesenheit von Eythroid Burst Forming Units (BFU-E), Erythroid Colony Forming Granulozyten-MAcrophase- (CFU-GM) und Erythroid Colony Forming Unit Macrophage (CFU-M) quantifiziert werden. Alle Experimente haben wir dreifach wiederholt. 

In vivo-Engraftment-Studien: Die in vivo-Engraftment-Kapazität der αβ-depletierten, mobilisierten Stammzellen wurde jüngst im NOD-scid IL2rnull-Modell beschrieben. Dieses Modell haben wir für unsere weitere Untersuchung genutzt. In Kürze: NOD-scid IL2rnull-Zellen wurden mit 325 cGy unter Verwendung eines 137Cäsium-Isotops (J. L. Shepard & Associates, San Fran Fernando, CA, USA) bestrahlt. Für die Transplantation werden Mäusen Zellen intravenös in eine Querader des Schwanzes injiziert - entweder mit αβ-T-Zell-depletierten Zellen, die auf insgesamt 1x 106 CD133-Zellen angepasst wurden, oder mit 1x 106 CD133+-Positivselektion mononukleärer Zellen vor der Depletion. Die Mäuse wurden nach acht Wochen getötet und auf menschliche Zellen in Knochenmark, Milz, Thymus und peripherem Blut untersucht. Das menschliche Engraftment hatten wir durch Doppelfärbung der Zellen mit einem Anti-Human-CD45- und Anti-Maus-CD45-Antikörper (Becton Dickinson) festgestellt, die Analyse erfolgte per Durchflusszytometer. Die humanen CD45+ -Zellen wurden dann auf CD19, CD3, CD4, CD8, αβ, γδ, CD14 und CD56 hin geprüft.

Ergebnisse - Erfassungsrate einer Interferenz bei Depletion

Um sicherzustellen, dass residuelle αβ-T-Zellen auch nach der Depletion verlässlich und genau erkannt werden konnten, wurden unbehandelte mononukleäre Zellen inkubiert - entweder direkt mit dem markierten FITC-anti-αβ-Antikörper BMA031 oder indirekt, mit dem mit Biotin-markierten Primer BMA031, gefolgt von magnetischem MicroBeads-anti-Biotin-Antikörper. Danach wurden sie mit dem FITC (Fluoresceinisothiocyanat)-markierten BMA031-Antikörper markiert. Wie in Abbildung 1 gezeigt, hatte die Markierung der Zellen mit dem MicroBeads-Biotin-markierten Primer BMA031 und dem MicroBeads-anti-Biotin-Antikörper keine Auswirkungen auf die Bindungsqualität des FITC-markierten BMA031-Antikörpers. Es gab nur eine geringe Abnahme der Färbungsintensität, jedoch waren αβ-T-Zellen nach immunomagnetischer Markierung (Abbildung 1) weiterhin eindeutig gefärbt. Nachfolgende Experimente mittels weiterer Methoden zur Feststellung von residuellen T-Zellen haben diese Ergebnisse bestätigt, wie zum Beispiel durch Kombinationen aus CD3, CD4, CD8, und dem T-Zell-Rezeptor (TCR) γδ. Es wurde kein Unterschied der Empfindlichkeit des Nachweises residueller αβ-T-Zellen festgestellt (Daten nicht gezeigt), und wir haben das FITC-markierte BMA031 weiterverwendet.

Depletion von αβ-T-Lymphozyten in großem Maßstab

Bei drei Spendern wurde eine Leukapherese ohne vorherige Stammzell-Mobilisierung durchgeführt. Bei vier Spendern wurde vor der Leukapherese mit G-CSF mobilisiert. Die durchschnittliche Zahl mononukleärer Zellen (MNC) vor αβ-T-Zelldepletion betrug 1,63 x 1010 (0,6-2,5 x 1010). Die durchschnittliche Ausbeute der MNC nach Depletion betrug 67% (56-75%). Der durchschnittliche Anteil an T-Zellen vor Depletion betrug 40,2% (21-67%). Der Anteil residueller Zellen nach der Depletion lag bei 0.02% αβ-T-Zellen (0,01%-0,04%). Die durchschnittliche gemessene Depletion an αβ-T-Zellen betrug demnach 3,9 (3,5-3,4) Größenordnungen (Log10). Die durchschnittliche absolute αβ-T-Zellzahl nach Depletion lag bei 1,8 x 106 (0,8 x - 3,6 x 106). Die Ergebnisse aus den mobilisierten Präparaten waren sehr ähnlich mit einer mittleren αβ-T-Zell-Depletion (log10) von 3,8 log-Stufen (3,5 - 4) und einer mittleren absoluten αβ-T-Zellen-Zahl von 1,36 x 106 (0,9-1,8 x 106). Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse vor und nach T-Zell-Depletion. Nach der Depletion von αβ-T-Zellen aus den G-CSF-mobilisierten PBSC der vier Spender betrug die durchschnittliche Ausbeute von CD34-Stammzellen 66% (57%-71%) (Tabelle 1). Die die mittlere Ausbeute von CD56+-NK-Zellen und γδ-T-Zellen nach Depletion aus nicht mobilisierten und mobilisierten Spendern betrug 80% (50-100%) beziehungsweise 92% (58-100%).

Funktionelle in vivo- und in vitro-Experimente

In vitro-Experimente zur Koloniebildung und in vivo-NOD-SCID IL2rnull: Um zu beurteilen, ob diese Methode zur αβ-T-Zelldepletion einen negativen Einfluss auf die biologische Funktion der Stammzellen hat, haben wir Repopulationsexperimente durchgeführt. Für die Kolonie-Experimente wurden unberührte MNC, αβ-T-Zell-depletierte MNC oder vor der Depletion aus den MNC aufbereitete CD133+-Stammzellen in gleicher Anzahl in Methylzellulose plattiert. Die Kolonien konnten nach 14 Tagen ausgewertet werden. Die Anzahl verschiedener Kolonien (BFU-E, CFU-M und CFU-GM) war bei den getesteten Zellpopulationen gleich (Daten nicht gezeigt). Bei den in vivo-Engraftment-Experimenten konnten wir zeigen, dass die Vorgehensweise der αβ-Depletion keinen Einfluss auf die Engraftment-Kapazität der Stammzellen hatte.

Im Knochenmark und Thymus von Mäusen, denen der αβ-depletierte Anteil injiziert wurde, konnten wir sogar ein besseres Engraftment menschlicher CD45+-Zellen beobachten als bei Mäusen, die mit der gleichen Menge an aufbereiteten CD133+-Stammzellen behandelt wurden. Der Anteil der erkennbaren menschlichen Zellen in Milz und peripherem Blut war bei beiden Gruppen gleich. Da dieses neubeschriebene Mausmodell myeloisches und lymphoides Engraftment unterstützt, haben wir die menschlichen CD45+-Zellen weiter auf Lymphozyten-Subpopulationen hin analysiert. In der detaillierten Analyse wiesen die Mäuse, denen αβ-depletierte Stammzellen gegeben wurden, ein Engraftment-Niveau von CD3+-Zellen auf, das mindestens dem der Mäuse glich, die CD133-positiv-selektierte Transplantate bekommen hatten. Die Mäuse der αβ-depletierten Gruppe wiesen signifikante Konzentrationen an γδ-T-Zellen auf, wie auch eine vielfach verzweigte Rekonstitution.

Fazit

Die hier dargestellte Methode ermöglicht eine neue Qualität der Transplantatmanipulation mit möglichen signifikanten Vorteilen. Die effektive αβ-T-Zelldepletion sollte die Verwendung von nicht HLA-passenden und NK-alloreaktiven Spenden ermöglichen. Darüber hinaus könnte sie die Anwendung von reduced-intensity conditioning (RIC)-Regimen (intensitätsreduzierte Konditionierung) und die Verkürzung intensiver Immunsuppression ermöglichen und so zu vorteilhafteren Krankheitsverläufen und geringerer Mortalität bei der allogenen Transplantation führen.

Literatur

[1] Originalarbeit: S Chaleff, M Otto, RC Barfield, T Leimig, R Lyengar, J Martin, M Holiday, J Houston, T Geiger, V Huppert and R Handgretinger (2007): A large-scale method for the selective depletion of αβ T lymphocytes from PBSC for allogeneic transplantation, Cytotherapy (9,) 8: 746-754

Korrespondenzadresse Prof. Dr. Rupert Handgretinger Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinik für Kinder- und Jugendmedizin Hoppe-Seyler-Straße 172076 Tübingen rupert.handgretinger@med.uni-tuebingen.de

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