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Expertenpanel

Zellbasierte Tox-Assays

Der Bedarf an in vitro-Toxizitätstests ist hoch – nicht zuletzt seitdem politische Entscheidungsträger den Ersatz von Tierversuchen bei der Substanztestung proklamieren. Der Fortschritt läuft dagegen langsamer als die politischen Absichtserklärungen. Denn die Test-Zulassung braucht im Durchschnitt 10 Jahre und verursacht hohe Kosten. Auch wenn es nach Experteneinschätzung nicht absehbar ist, ob und wann komplexe systemische Endpunkte, wie die Reproduktionstoxizität, die Toxizität bei wiederholter Gabe/Langzeittoxizität oder Toxikokinetik, mit in vitro-Tests messbar sein werden, laufen Versuche an, die Paramenter anhand von omics-Daten zu modellieren, wie etwa im von Jürgen Hescheler koordinierten Detective-Projekt oder dem Human Toxome Project.

Thomas Hartung

LABORWELT:

Welche Fortschritte gibt es bei in vitro-Toxizitätstests auf Basis von Metabolomanalysen?

Hartung:

Metabolomics ist auf dem Vormarsch in der Toxikologie. Von den gängigen Omics-Technologien ist sie am nächsten am Phänotyp, also den tatsächlich stattfindenden Veränderungen. Während wir mit 22.000 Genen und ihren Transkripten oder mehr als einer Million Proteinen umgehen müssen, gibt es nur wenige Tausend Metabolite, die wir recht gut inklusive ihrer metabolischen Verknüpfungen kennen. Insbesondere die Massenspektrometrie-basierten Methoden der Metabolomics haben in den letzten Jahren enorme Fortschritte bezüglich Standardisierung und Sensitivität gemacht, und die Kosten einer Einzelanalyse sind relativ niedrig.

Es wundert deshalb nicht, dass die Methode zunehmend in der Toxikologie genutzt wird. Pionierarbeiten bei BASF haben mit Kurzzeit-Tierversuchen für rund 500 Chemikalien gezeigt, dass sich typische Signaturen von Metaboliten-Veränderungen für eine ganze Reihe von toxischen Effekten im Blut nachweisen lassen. Dies wird bereits für eine biologische Gruppierung von Substanzen für Testungen im Rahmen der von der EU-Chemikalienrichtlinie REACH vorgeschriebenen Substanztestung eingesetzt und kann vermutlich Effekte in Langzeit-Versuchen vorhersagen.

Auch Zellkulturen kommen zunehmend zum Einsatz – wir haben bereits 2008 den Einsatz für Entwicklungsstörungen des Gehirns beschrieben, was jetzt von der FDA in unserem Labor gefördert wird. Stemina in Madison (USA) hat ganz ähnlich humane embryonale Stammzellen mit Metabolomics kombiniert und arbeitet mit der US EPA zusammen, um teratogene Effekte vorherzusagen. Zudem gibt es große Erwartungen, dass Metabolomics in vitro bei der Identifizierung von Toxizitäts-Pathways helfen kann, wie im NIH-geförderten Human Toxome Project angestrebt. Wir haben gerade mit BASF einen Workshop in Berlin veranstaltet, der die enormen Möglichkeiten dieser Technologie beleuchtete, aber auch noch zu meisternde Herausforderungen gezeigt hat. Ende des Jahres machen wir etwas ähnliches in den USA.   

Prof. Dr. Dr. med Thomas Hartung 
Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, Baltimore & Universität Konstanz

Jürgen Hescheler

LABORWELT:

Wie lassen sich komplexe Endpunkte künftig in vitro testen?

Hescheler:

Die Grundlage innovativer in vitro Toxizitätstests ist die Entwicklung von robusten, zuverlässigen, sensitiven und spezifischen Biomarkern. Dabei ermöglicht die systematische Auswertung von komplementären funktionellen und „-omics“ Technologien, einschließlich High-Content- und High-Throughput-Screening-Technologien, die Identifizierung und Untersuchung humaner Biomarker in zellulären Modellen. Während funktionelle Parameter Einblicke in die Wirkung von Schadstoffen auf spezifische Zellfunktionen geben, liefern „-omics“-Technologien Informationen zur gesamten zellulären Situation auf molekularer Ebene.

Die Auswirkungen von Wirkstoffen auf Epigenetik und microRNA-Expression versprechen, unser Verständnis von toxischen Wirkmechanismen vertiefen zu können. Diese beiden Parameter haben sich als kritisch für das Verhalten der Zelle herausgestellt und es gilt nun zu evaluieren, inwiefern die Anwendung von Chemikalien Zellen auf dieser Ebene beeinflussen. Durch Kombination und anschließende Integration der verschiedenen Technologien können Biomarker mit Vorhersagekraft für humane Toxizität in vitro entwickelt werden.

Basierend auf integrativer statistischer Analyse, systematischer Überprüfung und Korrelation mit in vivo-relevanten Daten, werden spezifische, sensitive und prädiktive Biomarker entwickelt. Die Definition genereller, relevanter humaner Toxizitätspathways für unterschiedliche Organsysteme eröffnet schließlich die Möglichkeit eines systemischen Ansatzes der Toxizitätstestung.

Prof. Dr. Jürgen Hescheler
Direktor des Instituts für Neurophysiologie an der Universität zu Köln

Dirk Dressler

LABORWELT:

Welche Fortschritte gibt es bei der Automation der in vitro-Genotoxizitätstestung?

Dressler:

Die in vitro-Prüfung einer Substanz auf genotoxischer Substanzeigenschaften erfolgt zur Zeit durch eine Kombination von verschiedenen Testverfahren, wobei jedoch z.T. falsch positive Aussagen auftreten. Der FADU-Assay (Fluorimetric detection of Alkaline DNA Unwinding) bietet hier neue Möglichkeiten. Er ist automatisiert einsetzbar und zeichnet sich durch eine hohe Sicherheit und eine einfache, schnelle und robuste Durchführung aus. Neben bereits etablierten Zelllinien werden nun auch komplexe Gewebemodelle als Testgrundlage etabliert. Mit dieser Technologie können DNA-Strangbrüche und DNA-Repair getrennt erfasst werden. Wichtiges Kriterium ist dabei, dass die Einwirkzeit der Testsubstanzen sehr variabel (von sehr kurz bis lang) gewählt werden kann.

So ist es erstmals möglich beide Prozesse in sensitiver und reproduzierbarer Weise zuverlässig zu detektieren. Es können wie gezeigt DNA Strangbrüche in peripheren Blutlymphozyten nachgewiesen werden, die von verschiedensten Chemikalien hervorgerufen wurden. Chemikalien ohne genotoxisches Profil fungierten als Negativkontrolle. Zur Zeit wird der FADU-Assay bei der Bewertung möglicher genotoxischer Eigenschaften von Nanopartikeln geprüft. So kann die Kombination von intelligentem Assay und Automatisierung die Grenzen der Analytik erweitern und für mehr Sicherheit bei der Bewertung sorgen.

Dr. Dirk Dressler
Leitender Mitarbeiter bei der BioTeSys GmbH (zuständig für die in vitro-Wirknachweis-Auftragsforschung)

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Heft 1/2012

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http://www.laborwelt.de/spezialthemen/zellbiologie/zellbasierte-tox-assays.html

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