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Blitzlicht

Schneller Erregernachweis mit Nanomembranen

Im Sommer 2001 hat die US-Gesundheitsbehörde FDA ihren strategischen Plan „Advancement of Regulatory Science“ veröffentlicht*. In diesem unterstreicht die Agentur vier Gebiete, in denen das Risiko für mikrobielle Kontamination in diversen produzierenden Industrien reduziert werden soll; eines davon ist die Reduktion des Risikos mikrobieller Verunreinigungen durch die Entwicklung „sensitiver, schneller Hochdurchsatz-Verfahren, um mikrobielle Kontaminationen zu detektieren, zu identifizieren und zu beziffern sowie ihren Nutzen bei der Einschätzung der Produktsterilität zu validieren“.

Für die pharmazeutische Industrie heißt dies, die für die mikrobielle Qualitätssicherung (QA) und -Kontrolle (QC) benötigte Zeit zu verkürzen – sowohl bei der Reinraum-Validierung, der In-Prozess-Kontrolle als auch bei der finalen sterilen Produktformulierung. Eine neue von NanoLogix entwickelte Technologie bietet eine Lösung: Durch eine signifikante Verbesserung der zuverlässigen Kulturmethoden in Petrischalen wird das mikrobielle Wachstum schnell erkannt. Die neue, auf Nanoporen-Membranen basierende Methode verringert die Zeit, um mikrobielle Kontaminationen zu erkennen auf allen Stufen des pharmazeutischen Produktionsprozesses. Durch die NanoLogix-Technologie verkürzt sich die Zeit des Kulturnachweises zum Beispiel von Listeria spp und E. coli von 18 bis 24 Stunden auf nur 5 Stunden. Salmonellenwachstum kann sogar schon nach vier Stunden beobachtet werden.

Die Verifikation steriler Bedingungen während des Produktionsprozesses – ob durch aseptisches Prozessing oder Sterilisation – ist oft nach wichtigen Schritten wie dem Ansetzen von Lösungen, dem Bulk Transfer, Abfüllen der Ampullen etc. erforderlich. Wenn multiple Haltezeiten für die In-Prozess mikrobiologische Testung benötigt werden, kann dies den Produktionsprozess um Tage verlängern, was den effizienten Einsatz von Ausrüstung und Personal erschwert. Zwar können für die In-Prozess mikrobiologische Testung alternative Verfahren wie PCR und Durchflusszytometrie eingesetzt werden, die schneller sind als die Kultivierung. Aber diese sind nicht imstande, auch nur annähernd brauch- und belastbare Ergebnisse zu liefern.

Dazu kommt, dass allein PCR-Tests eine 18-Stunden-Übernacht-Anreicherung benötigen können. Das mag kurz erscheinen. Doch haben solche In-Prozess-Haltezeiten ernste Folgen für die pharmazeutische Industrie. Denn während des Produktionsprozesses werden solche Tests zu verschiedensten Zeiten auf der Stufe der Prozessierung durchgeführt, und die Haltezeiten summieren sich und verlängern die Produktionszeit bis zum Endprodukt. Firmen können durch verlängerte Produktionszeiten an Wettbewerbsfähigkeit einbüßen, da eine kosteneffiziente Logistikkette essentiell für die Industrie ist. 

 

* Pharma QBD. FDA Releases Strategic Plan for Advancement of Regulatory Science, August 18, 2011. (Link)

Mangel an Alternativen zur Kultur

Da es nicht möglich ist, das Wachstum der Mikroorganismen zu beschleunigen, suchen pharmazeutische Unternehmen nach Verfahren, die schneller Ergebnisse liefern als die traditionellen mikrobiologischen Kulturmethoden. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) liefert Ergebnisse binnen Minuten, allerdings erst nachdem die Assays einen 18-stündigen Anreicherungsprozess über Nacht durchlaufen haben. Dazu kommmt, dass ein PCR-Screening nur die Anwesenheit von DNA detektieren kann, nicht dagegen verwertbare Informationen über bakterielles Wachstum. Zudem sind nach der PCR in der Regel weitere PCR- oder Kultur-basierte Verifikationsschritte notwendig, um festzustellen, ob den Prozess gefährdende Mikroorganismen präsent sind. Der Hauptnachteil der Durchflusszytometrie ist ihre geringe Durchsatzrate, was die effiziente Handhabung einer großen Probenanzahl ausschließt.

Eine einfache, schnellere Methode zur Kultivierung

NanoLogix‘ fortgeschrittene Kulturtechnologie erfüllt die Forderung der FDA nach einem sensitiven Schnelltest. Die Methode liefert belastbare Kultivierungsdaten vier- bis 24mal schneller als die konventionelle Kultivierung, abhängig von Bakterium und genutztem Produkt. Die Technologie ermöglicht es QA/QS-Technikern, das Wachstum von Mikrokolonien wesentlich schneller zu sehen und diese zu identifizieren als mit traditioneller Petrischalen-Kultur, PCR oder Durchflusszytometrie.

Obgleich das Verfahren derzeit nur in zwei Standard-Petrischalengrößen zur Verfügung steht, ist es grundsätzlich möglich, die Technologie in Well-plate-Arrays für das Hochdurchsatz-Screening zu überführen.

Das Funktionsprinzip

Herzstück der BioNanoPore (BNP)-Methode von NanoLogix ist eine permeable Polymermembran, die sich zwischen zwei Agarschichten befindet. Die extrem dünne, durchsichtige Membran gestattet es den Mikroorganismen, für einige Stunden zu wachsen. Dann, nach einem Bruchteil der herkömmlichen Inkubationszeit, wird die Membran auf eine Färbeplatte transferiert. Kapillarkräfte transportieren das Färbemittel – eine HRP-konjugierte Antikörper-Lösung – durch die Membran und bringen es in Kontakt mit den Mikrokolonien. Nach 10 bis 15 Minuten Färbezeit können die Mikrokolonien detektiert und identifiziert werden.

Bei der Testung eines parenteralen Produktes, ergab sich nach Filtration der „sterilen“ Lösung mit der BioNanoFilter (BFN)-Technologie eine Nachweissensitivität von einer Zelle pro Liter bei einer Nachweiszeit von vier bis sechs Stunden.

Damit hat die NanoLogix-Technologie das Potential, Produktionszeiten durch Verkürzung von In-Prozess-Haltezeiten zu reduzieren. Das Verfahren lässt sich auf jeder Stufe des Produktionsprozesses kosteneffizient, verlässlich und mit angemessenem Durchsatz implementieren. Diverse Wissenschaftler betrachten die Nanologix-Technology bereits als ‘neuen Goldstandard’ im Gebiet der Schnelldiagnostik*.

* Jonathan Faro, Allan Katz, Karen Bishop, Gerald Riddle, Sebastian Faro. „Rapid Diagnostic Test for Identifying Group B Streptococcus“. American Journal of Perinatology. Thieme eJournals, August, 2011. (Link)

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