Thema:

Durchflusszytometrie

Lange Leuchtdauern für schnelle Analysen – ReadyFlow

Durchflusszytometer (Flow Cytometer, FCM) erlauben einen schnellen Nachweis und die Analyse von biologischen Zellen und anderen mikroskopischen und submikroskopischen Partikeln, die mit hoher Geschwindigkeit an einem Lichtstrahl vorbeifließen. Das 1968 entwickelte Messprinzip der fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie wurde anfangs für die Untersuchung eukaryotischer Zellen und ihrer Zellteilung verwendet. Durch international immer weiter entwickelte biochemische Verfahren und eine zunehmend einfachere Handhabung wird das Messverfahren inzwischen in zahlreichen Gebieten eingesetzt: Medizinische und zellbiologische Grundlagenforschung, Routinediagnostik in Kliniken, Nanopartikel-Analysen und mikrobiologische Prozessüberwachung in der Lebensmittelproduktion sind nur einige Beispiele hierfür. Durch einen neuen Ansatz auf der Basis von biochemischen Sonden mit langer Leuchtdauer sollen nun im Rahmen eines vom BMWi geförderten Forschungsprojekts die Präzision verbessert und die Anwendungsmöglichkeiten erweitert werden.

Die Durchflusszytometrie ist ein Verfahren zur schnellen automatisierten Analyse der optischen Eigenschaften einzelner Partikel oder Zellen. Eine Probensuspension strömt durch eine hochpräzise optische Küvette (vgl. Abb. 1). Dabei wird der Probenfluss so fokussiert, dass die Zellen einzeln und nacheinander den Messbereich passieren. Zuvor in einem Präparationsschritt biochemisch an Zelloberflächen gekoppelte spezifische Leuchtsonden (Marker) werden durch einen Lichtstrahl angeregt. Mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelte monoklonale Antikörper sind in der FCM weit verbreitete Sonden, mit denen Zellen anhand ihrer spezifischen Zelloberflächen-Antigene erkannt und voneinander unterschieden werden können. 

Für jede Zelle werden Streu- und Fluoreszenzsignale von optischen Detektoren aufgenommen und mit schnellen Computerprogrammen ausgewertet und gezählt. In den gesammelten Daten lassen sich unterschiedliche Gruppen von Zellen voneinander differenzieren und ihre Zellzahl bestimmen. Nach Messzeiten von wenigen Sekunden bei bis über 10.000 Zellen je Sekunde können so Proben mit hoher statistischer Sicherheit analysiert werden.

Präziser Nachweis von Bakterien – neue Farbstoffklassen für FCM

In der Durchflusszytometrie können gleichzeitig mehrere Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Emissionsspektren analysiert werden. Dafür werden in mehreren optischen Spektralbereichen (z.B. im Grünen und Orangen) Fluoreszenzintensitäten analysiert. Mehrere Zellgruppen lassen sich dadurch in einer Messung voneinander unterscheiden (vgl. Abb. 2).

Bei dem Nachweis von Bakterien sollen möglichst kleine Zellzahlen schnell und sicher nachgewiesen werden. Häufig wird aber ein präziser und schneller Nachweis kleiner Zellzahlen gerade bei Mikroorganismen dadurch erschwert, dass die Lichtsignale der Fluoreszenzsonden durch eine natürliche Fluoreszenz (Autofluoreszenz) anderer Substanzen in der Probe oder in der Zelle störend überlagert werden. Eine sichere Interpretation der Messergebnisse ist dann oft mit hohem Aufwand verbunden oder sogar unmöglich.

Dieses Problem soll durch einen neuen Ansatz auf Basis von für die FCM neuen Farbstoffklassen und auf Grundlage zeitlicher Auflösung der Lichtsignale gelöst werden. Eine neuartige Kombination von lang leuchtenden Farbstoffsonden und angepasster Messgeometrie soll „saubere“ Messdaten liefern und damit das Einsatzspektrum von Durchflusszytometern signifikant erweitern.

Zeitaufgelöstes Messen für präzise Analysen

Die spektrale Differenzierung von verschiedenen Farbstoffen in der Durchflusszytrometrie ist Stand der Technik. Jedoch ist dieses Verfahren wegen störender spektraler Überlappungen limitiert: Erstens durch die Autofluoreszenz und zweitens wegen mehrerer Zielfarbstoffe untereinander, so dass eine präzise Unterscheidung in bestimmten Fällen nicht möglich ist. Um dieses Problem zu umgehen, sollen anstelle der üblichen Fluoreszenzsonden nun Phosphoreszenzmarker mit sogenannten Selten-Erd-Farbstoffen eingesetzt werden. Durch diese Leuchtstoffe lässt sich eine Emissionsstrahlung erzeugen, deren Dauer im Bereich von Millisekunden die der Autofluoreszenz um typischerweise mehr als das 1.000-fache übersteigt.

Das Prinzip ist unter anderem auch bekannt bei der Phosphoreszenz von Ziffernblättern in Armbanduhren – diese leuchten noch länger nach. Das gesamte Leuchtsignal jedes Partikels (Total Luminescence, vgl. Abb. 3) wird erst nach Abklingen der störenden Autofluoreszenz (Autofluorescence) aufgenommen, was eine Analyse ohne störende Hintergrundemissionen ermöglicht. Durch die Erweiterung der Messergebnisse um die Dimension Zeit ist bei diesem Vorgehen eine deutlich höhere Sensitivität gegenüber bestehenden Verfahren und eine einfachere Auswertung der eigentlich komplexen Datenausgabe eines Durchflusszytometers zu erwarten.

Eine weitergehende Analyse basiert auf der für verschiedene Farbstoffe charakteristischen Abklingkurve. Wenn sich die überlagernden Phosphoreszenz-Abklingzeiten der Farbstoffe (Abb. 3 Phosphorescence 1 & 2) ausreichend voneinander unterscheiden, können ihre Daten aus einer zeitaufgelösten Analyse der Abklingkurve (z.B. durch multi-exponentiellen Fit) voneinander separiert werden. 

Bisher können Phosphoreszenzmarker in der FCM nicht genutzt werden, da die lange Abklingzeit zum üblichen Messprinzip konträr ist. Lichtsignale von Zellen lassen sich üblicherweise nur in einem sehr kurzen Messfenster von wenigen Mikrosekunden detektieren, in dem sie sich im Fokus des Lasers befinden. Das „Nachleuchten“ über Millisekunden kann in bestehenden Geräten systembedingt nicht aufgenommen werden. Die Zellen oder Partikel verweilen dafür zu kurz im Messbereich. Es gibt wohl einige Ansätze für zeitaufgelöstes Messen, zum Beispiel durch zwei hintereinander geschaltete Messfenster1. Dieser Ansatz ist jedoch auch zeitlich sehr eingeschränkt und bisher nicht zur praktischen Anwendung gekommen. 

Ein Durchflusszytometer, das Abklingkurven solch lang leuchtender Phosphoreszenzmarker analysieren kann, benötigt eine spezielle, der Anregungsstelle nachgelagerte Messstrecke, die derzeit in keinem am Markt befindlichen Gerät vorhanden ist. Die Idee ist nun, durch eine optische Nachführung mit einem Kippspiegel das Phosphoreszenzsignal über einen längeren Zeitraum zu sammeln und zu detektieren (vgl. Abb. 4).

Dabei soll der Fokus durch optische Zeilensensoren und einen Kippspiegel, ähnlich denen in DLP-Projektoren, nachgeführt werden. Durch die deutlich verlängerte Messstrecke wird eine Zelle während der gesamten Abklingzeit verfolgt und eine Abklingkurve aufgenommen.

Forschungsprojekt READYFlow

Quantum Analysis entwickelt und produziert tragbare Durchflusszytomenter. Das iNano Institut der Hochschule Niederrhein hat sich auf die Verwendung von Selten-Erd-Farbstoffen in umweltanalytischen Diagnoseverfahren spezialisiert. Das iNano hat ein für die Anwendung geeignetes Messverfahren zum Patent angemeldet und stellt sein diesbezügliches Know-how zur Verfügung. Gemeinsam mit der Fachhochschule Münster, welche seit vielen Jahren Phosphoreszenzfarbstoffe und -marker erforscht, wurden bereits zahlreiche Leuchtstoffsonden entwickelt.

ReadyFlow soll als innovatives Verfahren der Durchlusszytometrie im Rahmen einer vom BMWi geförderten Zusammenarbeit innerhalb der nächsten zwei Jahre erforscht und zur Marktreife entwickelt werden. Dabei werden sowohl eine neue Gerätekomponente als auch passende Selten-Erd-Farbstoffe entwickelt. Neue Farbstoffsonden werden für die neue Gerätekomponente und Schlüsselanwendungen „maßgeschneidert“. Das neue Produkt soll präzise, mobil, einfach zu bedienen und preiswert sein, um eine tiefe Durchdringung im Diagnostik- und Analysemarkt zu ermöglichen.

Einsatzorte wären zum Beispiel der schnelle Nachweis von MRSA (Multi-resistenter Staphylococcus aureus) während der Patientenaufnahme im Krankenhaus oder die Analyse von Blutproben in einer Facharztpraxis. Derzeitige Durchflusszytometer sind in beiden Fällen zu teuer und arbeitsintensiv in der Dateninterpretation. Die 2011 aufgetretene Welle an EHEC-Infektionen (Enterohämorrhagische Escherichia Coli) zeigt die Notwendigkeit mobiler, preiswerter und vor allem schneller Testsysteme.

 

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Martin Gründkemeyer 
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