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Imaging

Zellteilungsdauer im High-Content-Screening bestimmen

Bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe für die Krebstherapie sind bildgebende Verfahren nicht mehr wegzudenken. Eines dieser Verfahren ist das High-Content-Screening. Dabei kann man herausfinden, ob bestimmte Substanzen die Teilung von Krebszellen und damit das Wachstum von Tumoren verringern oder sogar verhindern. Automatisierte Mikroskope generieren bei der Aufnahme sich teilender Zellen riesige Datenmengen, die in zeitaufwändigen Prozessen analysiert werden müssen. Die Etablierung dieser Experimente und die Auswertung der Bilddaten dauert dabei oft länger als die eigentliche Aufnahme der Bilder am Mikroskop. Deshalb ist es besonders wichtig, neue Software-Strategien zu entwickeln, die einerseits die Assay-Etablierung vereinfachen und gleichzeitig große Datenmengen in kurzer Zeit verarbeiten können. 

Krebs ist die zweithäufigste Todesursache in Deutschland. Auch wenn die Ausprägungen und Überlebensraten bei den verschiedenen Krebsarten sehr unterschiedlich sein können, haben alle Erkrankungen eines gemeinsam: Eine unkontrollierte Zellvermehrung führt zu Gewebewucherungen weit über die Organgrenzen hinaus. 

Die zelleigenen Mechanismen zur Wachstumskontrolle sind umprogrammiert, wodurch die Krebszellen potentiell unsterblich werden. Lösen sich einzelne Zellen aus dem Gewebeverband des Tumors, kommt es zur Metastasierung, und die Überlebenswahrscheinlichkeit des Patienten sinkt rapide. Um den Krebs möglichst rasch und vollständig zu bekämpfen, werden neue, noch spezifischere und besser wirkende Medikamente entwickelt. 

Wirkstoffscreening

Bei der Suche nach neuen Krebsmedikamenten werden Wirkstoffe auf lebende Zellen appliziert. Beim Wirkstoff-Screening geschieht dies viele Tausend- bis Millionen-Mal in verschiedenen Ansätzen. Wirkstoffe, die die Teilung von Krebszellen verhindern und gleichzeitig körpereigene Zellen unberührt lassen, haben dabei das Potential, ein Medikament zu werden. Bei bisherigen Versuchsansätzen geschah dies mit sogenannten Single-Time-Point-Assays. 

Die Zellen werden mit den Wirkstoffen inkubiert, zu einem bestimmten Zeitpunkt fixiert und anschließend gefärbt. Dabei hat man nur bedingt Kontrolle darüber, in welcher Phase sich die Mehrzahl der beobachteten Zellen gerade befindet. Um dies zu optimieren, müssen unter Umständen Verfahren angewendet werden, die eine Anreicherung der Zellen in der Zellteilung bewirken. Diese Verfahren sind nicht unkritisch, weil dadurch Zellen eventuell geschädigt werden oder ihre Eigenschaften sich verändern. Beides kann den Effekt von Wirkstoffen verfälschen. 

Neue Verfahren gehen einen anderen Weg: Beim Live-Cell-Imaging wird das Verhalten lebender Zellen über ihren gesamten Lebenszyklus aufgezeichnet. Solche Experimente entsprechen vielmehr der physiologischen Situation im Körper. Sie ermöglichen damit eine sehr viel detailliertere und qualifiziertere Aussage zum Effekt der untersuchten Wirkstoffe. Diese Art dynamischer Studien an lebenden Zellen sind grundsätzlich nur mit automatisierten Verfahren im höheren Durchsatz realisierbar. 

Ein computergesteuertes Mikroskop nimmt Bildsequenzen der lebenden Zellen auf, die anschließend von verschiedenen Bildanalysealgorithmen ausgewertet werden. Dies hat nennenswerte Vorteile gegenüber manuellen Verfahren: Ein Mensch ist nie vollständig objektiv bei der Analyse von Bilddaten. In der Biologie existieren häufig Grenzfälle, die mit automatisierten Verfahren trotzdem nach eindeutigen Kriterien bewertet werden können. Dies setzt voraus, dass die Bilddaten mit einer objektiven und robusten Bildanalysesoftware verarbeitet werden können. Nur so werden valide, statistisch abgesicherte Resultate möglich, die eindeutige Schlussfolgerungen zulassen. 

Eine Entwicklung des Fraunhofer FIT für diese Anforderungen ist die Software Zeta. Sie ist darauf ausgerichtet, den Flaschenhals der Analyse von High-Content-Screening-Daten zu verringern und den gesamten Prozess vom Experiment zum Ergebnis deutlich zu beschleunigen. Das Projekt Zeta wurde vor ca. 15 Jahren ins Leben gerufen und bereits bei einigen unterschiedlichen Fragestellungen eingesetzt[1,2].

Bildanalyse

Für das High-Content-Analyse-Team von Bayer Healthcare Berlin hat das Fraunhofer FIT eine neue Version der Software Zeta entwickelt. Sie kommt besonders gut mit großen Datenmengen zurecht, wie sie bei präklinischen Wirkstoffuntersuchungen anfallen. Ziel ist es, die Teilung von lebenden Krebszellen zu beobachten und zu quantifizieren. Eine besondere Herausforderung an die Bildanalyse besteht darin, die einzelnen Phasen der Teilung zu differenzieren und sie miteinander in zeitlichen Bezug setzen zu können. Die Zellen müssen nicht nur als Objekte erkannt und den einzelnen Zellteilungsphasen zugeordnet werden, auch das Erkennen der zeitlichen Abfolge ist wichtig. Für jede Zelle wird also eine Historie angelegt. 

Besonders großen Wert ist bei der Entwicklung von Zeta auf die einfache Bedienbarkeit, die Integrierbarkeit in bestehende Datenmanagementsysteme und die Performance gelegt worden. Mit wenigen Mausklicks wird die Software darauf trainiert, bestimmte Zellmuster zu erkennen und zu klassifizieren. Dadurch wird sie sehr flexibel und kann auch für andere biologische Fragestellungen eingesetzt werden. 

Der Zeta-Workflow

Eine Besonderheit von Zeta ist seine Plug-In-Struktur. Bei Arbeitsbeginn werden über eine Konfigurationsdatei bestimmte, für die Analyse notwendige Module in die Benutzeroberfläche geladen. 

Im Falle der Krebszellen sind folgende Plug-Ins sinnvoll: Registrierung, Vordergrund-Hintergrund-Erkennung, Segmentierung, Klassifikation, Zelltracking und Evaluation. Auswahl und Reihenfolge dieser Plug-Ins sind für die Analyse von Live-Cell-Imaging-Daten sich teilender Zellen optimiert. Der Benutzer kann sich während der Arbeit mit der Anwendung nacheinander durch die Plug-Ins klicken.

Bewegungsartefakte, die durch kleine Verwackelungen des Mikroskoptisches während der Bildaufnahme entstehen, werden durch das Registrierungs-Plug-In eliminiert. Dieses richtet die einzelnen Bilder einer Zeitserie neu zueinander aus. Der Prozess der Registrierung ist für jede Art von Live-Cell-Imaging-Daten erforderlich. 

Mit dem Vordergrund-Hintergrund-Plug-In werden die Zellobjekte vom Hintergrund getrennt. An dieser Stelle bietet Zeta ein interaktives Verfahren an. Der Benutzer markiert mit der Maus einige Zellen und Hintergrundregionen. Die Software lernt anhand dieser Beispiele, wie Zellen vom Hintergrund unterschieden werden können und gibt direkt ein visuelles Feedback. Der Anwender sieht, welche Regionen Zeta als Vordergrund und welche als Hintergrund klassifiziert hat, und kann diese Erkennung verbessern, indem er Beispiele hinzufügt oder entfernt. Die Software wird auf diese Weise trainiert, die Zellen vom Hintergrund bestmöglich zu trennen. Diese Trainierbarkeit ist ein Schlüsselkonzept der Software, weil dadurch die Flexibilität erhöht wird. 

Das Segmentierungs-Plug-In, ermöglicht die Trennung von Zellclustern in einzelne Zellobjekte. Dadurch ergibt sich die Möglichkeit, jede einzelne Zelle morphologisch zu beschreiben. Das Klassifikations-Plug-In ist für die Sortierung sich teilender Zellen besonders wichtig. Mit diesem Plug-In wird jede einzelne Zelle einer bestimmten Zellzyklusphase zugeordnet. Durch die integrierte Trainierbarkeit genügt es, einige Zellen beispielhaft mit einem Label zu versehen. Diese werden anschließend auf alle entsprechenden Zellen der Bildserien übertragen. 

Mit dem Tracking-Plug-In wird ein Zelltracking innerhalb der aufgenommenen Zeitserie durchgeführt. Hierbei wird für jede Zelle eine Historie angelegt, der zu entnehmen ist, wie lange sich eine Zelle in einer Zellzyklusphase befindet. Zudem bietet Zeta ein Evaluationsmodul an, mit dem die Informationen der einzelnen Analyse-Plug-Ins integriert werden und in Form einer csv-Datei exportiert werden können. 

Ausblick

Automatisierte, bildgebende Verfahren sind etablierte Hilfsmittel für die Suche nach neuen Wirkstoffen gegen Krebs. Oft ist dabei die Auswertung der generierten Daten ein Engpass innerhalb des Arbeitsprozesses. Die hier vorgestellte Software soll den Analyse-Workflow deutlich vereinfachen und beschleunigen.

Während eines automatisierten Screenings können derzeit etwa bis zu 50.000 Bilder pro Tag anfallen. Idealerweise ist der Algorithmus für die Bilderkennung so schnell, dass er in der gleichen Zeit fertig ist. Rechnerisch bleiben also weniger als zwei Sekunden pro Bild für die Analyse. 

In ersten Tests konnte Zeta diesen Wert mit einem Server mit 20 Prozessoren und 20 GB Arbeitsspeicher erreichen. Die Software-Architektur ist so angelegt, dass mit größeren Rechnern auch noch höhere Geschwindigkeiten erzielt werden können. Gegenstand der Forschung bleibt die Integration der Daten.

 

Literatur

[1] Malthan D, Huchler R, Brandenburg A, Thielecke H, Hildebrandt C, Zühlke D (2008). Association for Laboratory Automation, Abstracts: pp.74
[2] Scheede S, Herpens A, Burmeister F, Oltrogge B Saenger K, Schmidt-Rose T, Schreiner V, Wenck H, Knieps T, Berlage T (2011) Skin Research and Technology: 17(2):186-195 

 

Korrespondenzadresse

Dr. Andreas Pippow
Fraunhofer-Institut für Angewandte 
Informationstechnik FIT (Link)
Schloss Birlinghoven, 53754 Sankt Augustin

Tel.: +49-(0)2241-14-1524
Fax: +49-(0)2241-144-1524
andreas.pippow[at]fit.fraunhofer.de

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