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Zellbasiertes Screening

Ob bei der Bestimmung der Antikörper-Effektivität in Drug Screenings oder bei Single-Cell-Genexpressionstests: Zellbasierte Tests oder Tests an Einzelzellen helfen mehr denn je, die Wirksamkeit biologischer Medikamentenkandidaten und die Qualität von Zellmaterial zu bestimmen, das für das Biomarkerscreening eingesetzt werden soll. ADCC-Assays bestimmen etwa, wie stark glykooptimierte Antikörperwirkstoffe Immuneffektorzellen gegen Tumore scharf machen. Analysen von Einzelzellen gestatten darüber hinaus eine Einschätzung der Gewebeheterogenität und Identifizierung der Treibermechanismen von Krankheiten. Besonders wichtig erscheinen die Ergebnisse hochparalleler mRNA-Analysen an Einzelzellen für die Identifikation von Targets und Biomarkern. Zu aktuellen Herausforderungen bei der zellbasierten Testung sowie der Probenvorbereitung für Einzelzellanalysen befragte LABORWELT Experten der ProBioGen AG und Fluidigm Corp.

LABORWELT:

Wo liegen die derzeitigen Herausforderungen bei der zellbasierten Testung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC)?

Giese:

Zell-basierte Assays spielen eine zunehmend wichtige Rolle in der späten präklinischen Bewertung von Biopharmazeutika, nicht zuletzt durch die neue EMA-Richtlinie für Biosimilar-Antikörper. So erfahren nun auch ADCC-Assays für die Feststellung der Biosimilarität (Biosimilar assessment) und Vergleichbarkeit (Comparability exercise) sowie als Freigabetests eine Renaissance. Wo nun ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und Robustheit gefordert ist, werden die Schwachstellen Primärzell-basierter Assays offenkundig.

Die Performance von ADCC-Assays wird durch die Qualität der primären NK-Zellen bestimmt. Diese werden üblicherweise frisch aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) von Vollblutspenden isoliert, oder es werden PBMCs mit definierter NK-Zellmenge verwendet. Wie alle Primärzellen zeigen sie große spenderabhängige und präparationsbedingte Qualitätsschwankungen sowie wechselnde Ausbeuten. ADCC-induzierende Antikörper zeigen außerdem häufig Patientengruppen-spezifische Unterschiede in der Wirksamkeit. Diese lassen sich zum Beispiel auf Fcg-Rezeptor-bezogene Polymorphismen zurückführen (z. B. Fcg-RIIIa 158 V/F). Leider lassen sich in vitro diese Unterschiede aufgrund der Qualitätsschwankungen primärer NK-Zell-Präparationen kaum abbilden.

Für ADCC-Assays werden zudem Targetzelllinien für die jeweilige therapeutische Indikation benötigt. Ihre Qualität bestimmt ebenfalls die Assay-Performance. Neben einer ausreichenden Markerexpression sind hier insbesondere die spontane, Antikörper-unabhängige Lyse durch NK-Zellen, die Anfärbbarkeit mit geeigneten Vitalfarbstoffen sowie deren spontane Freisetzung von Bedeutung. Diese Faktoren bestimmen wesentlich die technische Leistungsfähigkeit der ADCC-Assays (Signal-to-noise ratio). Bestehende NK-Zelllinien sind von unbefriedigender Qualität, daher kommen zunehmend Surrogat-Modelle und rekombinante Zelllinien mit NK-Zell-Funktionalität zum Einsatz.

LABORWELT:

Wie können Einzelzellen für Genexpressionsanalysen und das Next Generation Sequencing effektiv isoliert und präpariert werden?

Shuga:

Shallow sequencing, zu deutsch „oberflächliches Sequenzieren“, großer Zahlen einzelner Zellen bietet die bestmögliche Abbildung der Vielfalt und Expressionsspanne in Zellpopulationen. Es ist noch nicht lange her, dass ein konzeptioneller Wandel die Sichtweise auf die RNAseq-Analyse in Einzelzellen verändert hat. Wissenschaftler hatten entdeckt, dass das sogenannte Shallow Sequencing einzelner Zellen ausreichend genug Daten lieferte, um Zellen mit ähnlichen Eigenschaften zu unterscheiden. Das Verfahren reduziert zugleich die Sequenziertiefe um zwei Größenordnungen – von 5 Millionen auf 50.000 Reads. Zusätzlich entdeckten sie, dass ein Erhöhen der Zahl der untersuchten Zellen im Vergleich zum Sequenzieren mit größerer Tiefe ein besseres Verständnis der Zelldiversität und Expressionsstärken in Zellpopulationen ermöglichte. Dazu kommt: Die Untersuchung zahlreicher Einzelzellen kann zur Identifikation seltener Zellpopulationen, Entwicklungsstadien und Biomarker führen, die bei normalen Gewebestudien verborgen bleiben.

Entscheidend, um diese neue Technologie anzuwenden, ist eine einfache, kostengünstige und reproduzierbare Probenvorbereitung. Fortgeschritte Strategien zum Barcoding der Zellen gestatten dabei die parallele Sequenzierung großer Einzelzellmengen in ultra-niedriger Tiefe. Eine Lösung am Markt ist etwa das Fluidigm C1-Single-Cell Auto Prep-System. Es fängt standardmäßig bis zu 96 Einzelzellen auf einmal ein und führt die reverse Transkription and cDNA-Amplifikation in Nanoliter-Reaktionsvolumina durch, was die wirksame Konzentration der Reaktanden erhöht und so die Genauigkeit der mRNA-Sequenzierung verbessert.

Fluidigm hat zwei frei verfügbare Tools entwickelt, um die Erzeugung hochqualitativer Daten bei jedem Lauf zu ermöglichen, in dem Einzelzellen analysiert werden. Der Single-Cell Preparation Guide (Download: www.fluidigm.com/single-cell-prep-guide.html) bildet die Schritte ab, die zur Präparation qualitativ hochwertiger Einzelzell-Suspensionen erforderlich sind – unabhängig davon, ob mit Primärzellkulturen, adhärent wachsenden oder Zellen in Suspensionskultur gearbeitet wird.

Zusätzlich bietet das SINGuLAR™ Analysis Toolset 3.0 Hilfe – ein intuitives, einfach handhabbares Datenanalyse-Werkzeug für das Single-cell-DNA-Sequencing, die Genexpressionsanalyse, miRNA-Profilierung sowie die Analyse von mRNA-Sequenzierungs-Datensätzen. Das Toolset auf Basis der verbreiteten statistischen Programmiersprache R ermöglicht die schnelle Analyse und den raschen Vergleich von transkriptionellen oder unterschiedlichen Profilen.

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4/2014

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http://www.laborwelt.de/spezialthemen/zellbasierte-assays/zellbasiertes-screening.html

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