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Fachbeitrag

Multimode-Reader mit zellulärer Auflösung

Mit einem Weltmarktanteil von 20% zählt PerkinElmer zu den führenden Entwicklern für zelluläre Imaging-Instrumente. Das Unternehmen wagte als eines der ersten den Schritt vom monofunktionellen Mikroplatten-Reader der Vergangenheit zum heutigen Multimode-Mikroplatten-Reader.

Jetzt bahnt sich eine weitere große Entwicklung an: die Kombination der Well-Imaging-Technologie mit dem klassischen Multimode-Reader in einem einzigen Messgerät. Die Auflösung einzelner Zellen mittels Well-Imaging erlaubt es dabei, die Qualität zellbasierter Assays deutlich zu steigern. Der neue PerkinElmer EnSightTM Multimode-Mikroplatten-Reader ist ein vielseitig einsetzbares Messgerät für biochemische und zelluläre Assays im Mikroplatten-Format. Neben den konventionellen Messmodi – Absorption, Fluoreszenz-Intensität, zeitaufgelöste Fluoreszenz, Lumineszenz und AlphaScreen/AlphaLISA – weist der EnSight Label-free- und nun auch zelluläre Well-Imaging-Technologie auf. Mit seiner Vielfalt an Mess-Modi bietet EnSight eine einzigartige Kombination an Detektionstechnologien für die akademische, klinische und Pharma-Forschung. Der Reader verwendet dabei die neue KaleidoTM-Software zur Datenerzeugung und -analyse. Zugleich kontrolliert Kaleido alle Gerätefunktionen. Kaleido beruht auf der ebenfalls von PerkinElmer entwickelten Acapella® High Content Imaging- und Analyse-Software. Die Kombination von EnSight und Kaleido erlaubt die Messung und Analyse von targetbasierten und phänotypischen Assays in einem Gerät.

Die neue Well-Imaging-Technologie des EnSight erlaubt bildbasierte Zytometrie-Messungen und umfasst Durchlicht-, digitale Phasenkontrast- und 4-Farb-Fluoreszenz-Mess-Modi. Das Anwendungsspektrum reicht dabei von Messungen der Zellzahl, der Konfluenz, der Inter- und Intra-Well-Zellverteilung, zellmorphologischer Veränderungen, zellulärer Fluores­zenzsignale, von Reporter-Genen oder Zell-Markern bis hin zu zytotoxischen Effekten.

Verbesserung der Qualität zellulärer Assays mit Zytometrie-Messungen

Zytometrie-Messungen, wie Zellzahl-Bestimmung und Konfluenz-Analyse, stellen wichtige Qualitätskontroll-Parameter in zellbasierten Assay-Anwendungen dar. Neben der Überprüfung der Zellzahl pro Well, welche anschließend für Normalisierungszwecke verwendet werden kann, liefert zum Beispiel die Konfluenz-Analyse Informationen zum korrekten Aussäen beziehungsweise Zustand der Zellen. Die Anwendung von Normalisierung und Zell-Qualitätskontrolle im Rahmen der Assay-Durchführung erhöht die Datenqualität zellulärer Assays zum Teil beträchtlich. Da die Bilderfassung beim EnSight sehr schnell vonstattengeht (bei 1 Farb-Fluoreszenz-Messung etwa vier Minuten pro 384 Well-Platte) und weil für Durchlicht- oder DPI-Messungen keine kostspieligen oder tox­ischen Farbstoffe verwendet werden müssen, stellt der EnSight ein ideales Instrument für derartige Anwendungen dar.

Um die unterschiedlichen Zytometrie-Mess-Modi zu vergleichen, wurden die Korrelationskoeffizienten zwischen ausgesäter Zellzahl und der jeweils mit Hilfe des EnSight gemessenen Zellzahl/Konfluenz bestimmt. A431- und HeLa-Zellen wurden hierzu mit einem CASY® Cell Counter gezählt und in 384-Well-CellCarrier-Platten ausgesät. Abbildung 1 zeigt ausgewählte Bilder für DPI- und Fluoreszenz-Messungen mit dem EnSight für A431- und HeLa-Zellen. In der Tabelle sind die Ergebnisse der vergleichenden Messungen zusammengefasst. Sie zeigen, dass der EnSight durchweg sehr gute Korrelationskoeffizienten (r2) zwischen 0,82 und 0,97 für derartige Messungen liefert.

Abbildung 2 illustriert den Einfluss von fehlerhaftem Aussäen der Zellen anhand von Konfluenz-Messungen im Durchlicht-Modus. Während die Zellkonfluenz nach korrektem Aussäen bei über 30% liegt, führen eingeschlossene Luftblasen während des Aussäens oder das Berühren des Plattenbodens mit der Pipettenspitze zu verminderter Zellkonfluenz (20% bzw. 25%). Derartige Abweichungen sind bei höheren Probenzahlen manuell nur noch mit hohem Aufwand zu bestimmen, mit Hilfe des EnSight jedoch sehr einfach messbar. Auf Grund der Verfügbarkeit von Zytometrie-Messungen im selben Gerät, in dem auch der eigentliche Assay gemessen wird, ergibt sich zudem eine logistische Vereinfachung des Gesamtassay-Ablaufes.
Neben fehlerhaftem Aussäen kann auch bakterielle Kontamination den normalen Assay-Ablauf empfindlich stören. Abbildung 3 zeigt am Beispiel von MCF-7 Zellen wie die mit Hilfe der Kaleido-Software bestimmbaren Parameter Konfluenz und Rauigkeit („roughness“) sich bei Anwesenheit bakterieller Kontamination im Durchlicht-Modus verändern: Während die Konfluenz nach bakterieller Kontamination zunimmt, werden die „roughness“-Messwerte parallel dazu kleiner. Auch derartige unerwünschte Effekte sind im normalen Assay-Ablauf nur sehr schwer manuell nachzuweisen, ihre einfache, schnelle Messung wird durch den EnSight ermöglicht.

Fazit: Der EnSight Multimode-Mikroplatten-Reader schließt eine wichtige Lücke im Geräte-Spektrum zwischen Multimode-Mikroplatten-Readern ohne Well-Imaging und reinen bildbasierten High Content Screening-Systemen mit sub-zellulärer Auflösung. Nicht zuletzt die Kosten-Nutzen-Abwägung in Zeiten knapper Fördermittel und Forschungsbudgets eröffnet dem EnSight eine vielversprechende Zukunft.

Kontaktadresse:

Dr. Michael Lässle
PerkinElmer Cellular Technologies Germany GmbH
Schnackenburgallee 114
22525 Hamburg

michael.lassle[at]perkinelmer.com

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4/2014

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