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Mikroplattenoptimierung: 96 Ergebnisse aus 96 Wells

Für die Analyse zellulärer Reaktionen mit Hilfe zellbasierter Assays kommen häufig 96-Well-Platten zum Einsatz. Durch den sogenannten Edge Effect können die Ergebnisse in den äußeren Wells aber stark variieren. Deshalb werden häufig nur 60 der 96 Wells bei der späteren Auswertung genutzt. Dies bedeutet einen Verlust von 38% der Platte. Eine neue Zellkulturplatte bietet nun die Möglichkeit, den Edge Effect zu minimieren und dadurch effizienter und ressourcenschonender zu arbeiten.

Zellbasierte Assays gewinnen in nahezu allen Bereichen der biologischen Forschung an Bedeutung. Die Möglichkeit, Assays an Hochdurchsatzverfahren anzupassen, macht diese unentbehrlich. Sie werden zum Beispiel in der pharmazeutischen Forschung eingesetzt, um potentielle Medikamente zu identifizieren. Die Aussagekraft der erhaltenen Daten beruht auf der gleichbleibend hohen Qualität der durchgeführten Assays. Es gibt allerdings zahlreiche Faktoren, die zur Unbeständigkeit in Multi-Well-Platten beitragen können. Einige davon können durch die Optimierung von Routineschritten im Labor vermieden werden. So helfen etwa sorgfältiges Mischen und Dissoziieren der Zellen vor dem Aussäen und das Vermeiden von Luftblasen beim Pipettieren, Unterschiede in Zellwachstum und -adhäsion zu minimieren. Natürlich spielt auch die Bestimmung optimaler Wachstumsbedingungen für den jeweils verwendeten Zelltyp eine Rolle. Die Zusammensetzung des Zellkulturmediums und die Aussaatdichte sollten für jeden Zelltyp angepasst werden.

Der sogenannte Edge Effect kann durch diese Maßnahmen allerdings nur selten vermieden werden. Da Well-zu-Well-Variationen in Assay-Ergebnissen hauptsächlich in den äußeren Wells der 96-Well-Platte eine Rolle spielen, wird dieses Phänomen als Rand-Effekt („Edge Effect“) bezeichnet. In der Literatur finden sich keine eindeutigen Erklärungen der Ursachen des Edge Effects. Häufig werden Temperaturunterschiede innerhalb der Platte und Verdunstung in den Rand-Wells während der Inkubation als mögliche Faktoren genannt, die unregelmäßiges Zellwachstum, insbesondere an der Peripherie der Platte, zur Folge haben können [1,2]. Es wird allgemein angenommen, dass Verdunstung in den äußeren Wells zu einer Anreicherung von Medienkomponenten wie Salzen führt, was wiederum den Zellstoffwechsel beeinflusst. Temperaturschwankungen können ebenfalls ungleichmäßige zelluläre Reaktionen hervorrufen. Beide Faktoren – Verdunstung und Temperaturschwankungen – können zu höheren Varianzen zwischen den einzelnen Wells und somit letztendlich zu unzuverlässigen und schwer reproduzierbaren Ergebnissen beitragen.

Was tun? – Methoden, um den Edge Effect zu vermeiden

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, den Edge Effect zu verhindern. Ein Ansatz, um die Auswirkungen eines Temperaturgradienten zu minimieren, ist die Vorinkubation der Platte mit frisch ausgesäten Zellen bei Raumtemperatur. Lässt man die Platte für ein bis zwei Stunden außerhalb des Inkubators stehen und überlässt die Zellen sich selbst, wird man in der Regel mit einem gleichmäßigen Zellrasen belohnt, der sich von Well zu Well über die ganze Platte verteilt [3]. Allerdings bezieht sich der Edge Effect nicht unbedingt auf gleichmäßiges Zellwachstum. Auch das schönste Monolayer kann Ergebnisse produzieren, die die Standardabweichung in die Höhe und dem Forscher die Tränen in die Augen treiben. Je nach verwendetem Zelltyp ist eine Vorinkubation bei Raumtemperatur außerdem nicht ratsam, da manche Zellen auf Temperaturen unterhalb von 37°C empfindlich reagieren.

Für Anwendungen, bei denen längere Inkubationszeiten vonnöten sind, stehen verschiedene Gerätschaften, wie Feuchtigkeits- und Temperaturkammern, zur Auswahl. Ihr Zweck ist die Erschaffung einer gleichbleibenden Mikroumgebung, in der ein nahezu konstantes Niveau an Luftfeuchtigkeit und Temperatur herrscht. Die vielleicht gängigste Methode zur Verhinderung des Edge Effects ist, die äußeren Wells nur mit Medium zu füllen, aber keine Zellen einzusäen. Simpel und effektiv könnte man meinen – allerdings ist dies eher die Vermeidung eines Problems als dessen Lösung. Das Nichtbenutzen der äußeren Wells einer 96-Well-Platte reduziert die Anzahl der verfügbaren Wells auf 60, eine Verminderung des Plattendurchsatzes um 38%. Zwar kann der Edge Effect so vermieden werden, aber diese Methode resultiert in höheren Kosten für Einmalartikel, beansprucht mehr Platz im Inkubator und kostet mehr Zeit.

Macht die Platte den Unterschied aus? Zellkulturplatten im Vergleich

Getestet wurden die neue Eppendorf 96-Well-Zellkulturplatte sowie drei Zellkulturplatten anderer Hersteller (A, B und C). Die Eppendorf-platte ist mit einem umlaufenden Graben ausgestattet, der mit Flüssigkeit gefüllt werden kann (z. B. mit sterilem Wasser oder PBS). Dadurch werden die äußeren Wells isoliert. Zusätzlich kann der Raum zwischen den inneren Wells mit nur einem Pipettierschritt gefüllt werden. Das beugt nicht nur Temperaturschwankungen während der Inkubation vor, sondern führt auch dazu, dass die Zellen nicht so schnell kalte Füße kriegen, wenn sich die Platte längere Zeit außerhalb des warmen Inkubators befindet (zum Beispiel beim Mikroskopieren). Vor dem Einsäen der Zellen sollte man die Platte mit den gefüllten Zwischenräumen und/oder dem gefüllten Graben im Inkubator vortemperieren. Die Platte von Hersteller A wird als Assayplatte beworben und ist mit vier Reservoirs ausgestattet, die mit Flüssigkeit gefüllt werden können.

Die Platten von Hersteller B und C sind Standardplatten, die keine Möglichkeiten bieten, die Zwischenräume zu befüllen. Die Platten wurden entsprechend mit Flüssigkeit gefüllt (in den Wells und wenn möglich außerhalb der Wells), vortemperiert und dann fünf Tage unter Standardbedingungen (37°C, 5% CO2, befeuchtete Atmosphäre) inkubiert. Um ein möglichst realistisches Laborszenario zu simulieren, wurde die Tür des Inkubators mehrmals am Tag kurz geöffnet. Der Flüssigkeitsverlust in jedem einzelnen Well wurde mit Hilfe einer Kristallviolettlösung und dem Eppendorf PlateReader AF 2200 bestimmt. Anhand einer Kalibrierungskurve wurde dann die Verdunstung in Prozent berechnet (siehe Abbildung 2).

Bei längeren Inkubationszeiten wird die Verdunstung in 96-Well-Platten zu einem kritischen Faktor. Insbesondere in Rand-Wells tritt Flüssigkeitsverlust durch Verdunstung auf, da diese Wells nicht vollständig von benachbarten Wells umgeben sind. Das Isolieren der Rand-Wells mit Flüssigkeit kann die Verdunstung reduzieren. Ohne Isolierung zeigen die äußeren Wells der Eppendorf 96-Well-Zellkulturplatte nach fünftägiger Inkubation unter Zellkultur-Standardbedingungen eine durchschnittliche Verdunstung von nur 1,8%. Der geringe Flüssigkeitsverlust ist wahrscheinlich auf die optimierte Passgenauigkeit von Deckel und Platte zurückzuführen. Das Befüllen des äußeren Grabens mit Flüssigkeit reduziert die Verdunstungsrate auf weniger als 1%. Wie in Abbildung 1 gezeigt, ermöglicht das „Chimney-Well“-Design der Eppendorf-Platte die zusätzliche Befüllung des Well-Zwischenraumes, was die Verdunstung in den Rand-Wells auf lediglich 0,3% sinken lässt. Jede Flüssigkeit, wie steriles PBS, Wasser oder Zellkulturmedium eignet sich zum Befüllen des Grabens und des Zwischenraumes. Durch die Konstruktion der Eppendorf-Zellkulturplatte lässt sich der komplette Zwischenraum mit nur einem Pipettierschritt befüllen.

Der Vergleich verschiedener 96-Well-Zellkulturplatten (s. Abb. 2 und Tabelle) zeigt, dass die Eppendorf-Zellkulturplatte die einzige Platte ist, welche die Verdunstung effektiv minimiert. Hersteller A bietet die Möglichkeit einer teilweisen Isolierung der äußeren Wells; allerdings konnte hier nach wie vor ein deutlicher Edge Effect beobachtet werden wenn auch abgeschwächter, im Vergleich zu den Herstellern B und C. Das Befüllen des gesamten Well-Zwischenraumes der Eppendorf-Zellkulturplatte trägt zu einer homogenen Feuchtigkeitsverteilung und Temperaturstabilität innerhalb der Platte bei. Dies führt zu einer verminderten Verdunstungs- und Kondensationsrate, was den Edge Effect drastisch reduziert.

Literatur:

1]  Walzl A, Kramer N, Mazza G, Rosner M, Falkenhagen D, Hengstschläger M,     Schwanzer-Pfeiffer D, Dolznig H. Int J Appl Sci Technol. 2012 June; 2(6):
[2]  Patel MI, Tuckerman R, Dong Q Biotechnology Letters 2005; 27: 805–808
[3]  Lundholt BK, Scudder KM, Pagliaro L Journal of Biomolecular Screening 2003; 8: 566

Kontaktadresse:

Jessica Wagener
FieldApplication Specialist - Cell Handling Eppendorf AG
Barkhausenweg 1
22339 Hamburg

wagener.j[at]eppendorf.de

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