Thema:

Interview

3D-Modelle: Physiologisch, aber herausfordernd

Angesichts des Scheiterns zahlreicher Arzneikandidaten in später klinischer Phase wird der Ruf nach kostengünstigen zellbasierten Testsystemen, die die Wirkungen im Menschen realistisch nachstellen, lauter. Fristeten Arzneitests in dreidimensionalen Zellkulturen vor 15 Jahren noch ein Mauerblümchen-Dasein, finden die ersten bereits heute Anwendung in der biopharmazeutischen Industrie. LABORWELT sprach mit Prof. Dr. Helmut Dolznig von der Medizinischen Universität Wien über die Herausforderungen und Chancen bei der Entwicklung dreidimensionaler Krebsmodelle, die die Wechselwirkungen von Tumor und Tumormikroumgebung nachstellen.

LABORWELT:

Herr Professor Dolznig, das Wachstum und die Neigung zu metastasieren, wird von Zellen in der Mikroumgebung von Tumoren mitgesteuert. Wie lässt sich so etwas in Zellkulturen, zum Beispiel beim Wirkstoffscreening, untersuchen?

Dolznig:

Tatsächlich wird immer klarer, dass ein fein orchestriertes Wechselspiel des Tumors mit den Bindegewebszellen, die diesen umgeben, mit Immunzellen, die in ihn einwandern und mit Blutgefäßzellen, die ihn durchziehen, verantwortlich für das Verhalten von Karzinomen ist. Diese Erkenntnis führt langsam auch zu einem Umdenken beim Screening von Wirkstoffen mit zellbasierten Assays, das heute meistens mit sogenannten 2D-Tests durchgeführt wird. Die bisher meistangewandte Methode ist es, einen zweidimensionalen (2D) Zellrasen von Tumorzellen in 96- oder 384-Well-Platten in Wachstumsmedium zu inkubieren und daran den Wirkstoffkandidaten zu testen. Dies hat zwar den Vorteil, dass es schon zahlreiche etablierte zellbasierte 2D-Assays und Hochdurchsatz-Analyseverfahren gibt, mit denen sich Zellproliferation, Toxizität und Zellmigration untersuchen lassen. Die 2D-Assays spiegeln aber nur sehr ungenügend das komplexe Geschehen und vor allem die komplexen Wechselwirkungen zwischen Tumor und Tumorstroma wider, das immerhin 70% der gesamten Tumormasse ausmachen kann. Etwas realistischer wird es bereits, wenn mit dem Zellkulturüberstand gearbeitet wird, der all die Zytokine und Signalmoleküle enthält, die zum Beispiel die Fibroblasten des Tumorstromas ausschütten. Gleichwohl muss man sich darüber bewusst sein, dass die so geschaffenen Bedingungen nur die halbe Wahrheit sind, denn so ein Assay bildet nicht exakt das Mikromilieu ab, das durch das Wechselspiel von Tumor und Tumormikroumgebung entsteht. Zudem lassen sich zahlreiche Aspekte der Tumorbiologie wesentlich realistischer in 3D- als in 2D-Modellen darstellen. Wenn in diesen Ansätzen sogenannte Tumorzell-Sphäroide verwendet werden, also dreidimensionale (3D) Aggregate von Krebszellen, kommt ein weiterer Aspekt eines Tumor im Menschen hinzu, nämlich dessen räumliche Ausdehnung.

LABORWELT:

Also anstelle von 2D-Zellmodellen einfach 3D-Tumorzellmodelle nutzen?

Dolznig:

So einfach ist es leider nicht. Denn die 2D-Assays zur Untersuchung des Stoffwechsels, der Zellvitalität, der Wirkstofftoxizität oder des Zellwachstums lassen sich nicht so einfach in 3D übertragen. Ein Beispiel dafür ist der Alamar-Blue-Assay, bei dem die Reduktion des Farbstoffs Resazurin zum deutlich fluoreszierenden Resorufin als indirektes Maß für die Zellviabilität dient. Dieser Assay funktioniert oft nicht mit 3D-Tumorzellsphäroiden. Warum? In 2D-Assays sieht jede Zelle gleich aus. Sie ist sehr flach, weil sie keinen oder nur eingeschränkten Kontakt zu benachbarten Zellen hat und einzeln an die Plastikplatte angeheftet ist.

Bei Sphäroiden ist das anders: Ähnlich wie im Tumor nehmen die epithelialen Zellen engen Kontakt zueinander auf und wachsen gleichzeitig über- und nebeneinander. Dazu kommt: Ähnlich wie im Tumor gibt es im Sphäroid Gradienten, zum Beispiel für Sauerstoff, Nährstoffe, Stoffwechselprodukte, Wirkstoffe etc. Dies führt dazu, dass es innerhalb des Sphäroids ganz unterschiedliche Zellzustände gibt; hochproliferative, hypoxische, ruhende oder nekrotische, die dem zu testenden Antikrebs-Wirkstoff zudem – aufgrund der graduellen Durchdringung – unterschiedlich stark ausgesetzt sind. Das hat direkte Konsequenzen auf die Übertragbarkeit von 2D auf 3D.

LABORWELT:

Welche?

Dolznig:

Das Problem liegt nicht in der Reproduzierbarkeit, der Zusammensetzung und Zahl der Sphäroide, sondern in ihrer dreidimensionalen Tiefe. Dadurch ist ein Farbstoff wie etwa Resazurin nur in der äußersten Zellschicht verfügbar, was zu falschen Messwerten führt. Noch komplizierter wird es, wenn sogenannte organotypische Sphäroid-Assays eingesetzt werden, bei denen Sphäroide und Stromafibroblasten gemeinsam in einem
Kollagengel kultiviert werden, um auch die Tumor-Stroma-Interaktion zu berücksichtigen. Wir können mikroskopisch die Größen­veränderung der Sphäroide pro Zeiteinheit messen, also das Tumorwachstum. Das machen wir manuell, also low-tech. Pharmaunternehmen führen aber hier bereits automatisierte Screenings mit Tumorzellsphäroiden durch. Eine einfache Detektion der Wirksamkeit bestimmter Substanzen in organotypischen 3D-Tumormodellen steht dagegen noch ganz am Anfang, denn es gilt Wege zu finden, die Drug Response der Tumorzellen im Tumor-Stroma-Verbund zu messen. Ein Weg, nicht die Summe der Ergebnisse von Tumor- und Stromazellen zu erfassen, ist es, Tumorzellen einzusetzen, die konstitutiv Luciferase exprimieren, und dann die Lichtentwicklung dieser Zellen zu quantifizieren. Da nur lebende Krebszellen Luciferase bilden, kann auf diesem Weg gemessen werden, wie viele Krebszellen eine Behandlung überlebt haben. Das gibt eine Aussage über die Effizienz des zu testenden Wirkstoffs.

LABORWELT:


Gibt es bereits 3D-Zellmodelle, die nicht hausgemacht sind, sondern vermarket werden?

Dolznig:

Es gibt viel Laborausrüstung, um 3D-Kulturen zu züchten – Platten, Matrices etc. –, aber nur wenige Anbieter von aussagekräftigen 3D-Assays oder von entsprechenden Screening-Dienstleistungen. Bei organotypischen Assays ist darauf zu achten, dass diese auch tatsächlich die physiologischen Gegebenheiten widerspiegeln, also nicht etwa immortalisierte Stromazellen aus anderen Organen oder gar anderen Spezies als dem Menschen nutzen.

LABORWELT:

Wie lassen sich 3D-Assays bereits heute sinnvoll in der Arzneientwicklung nutzen?

Dolznig:

Da derzeitige Tests in Tumorzellsphäroiden oder organotypischen Modellen allesamt nicht im hohen Durchsatz durchgeführt werden können, ist sicher eine Priorisierung sinnvoll. Praktisch heißt das: Ich nehme die im Primärscreening identifizierten Leitstrukturen und untersuche, ob diese auch in einem physiologisch relevanteren Modell noch wirken. In diese Richtung wird die Entwicklung gehen. Dass diese Strategie – wenngleich langsam – auch auf Interesse stößt, zeigen Kooperationen wie das PREDECT-Projekt innerhalb der „Innovative Medicines Initiative“, in dessen Rahmen Forscher und Firmen zusammenarbeiten, um realistischere Zell­modelle für Brust-, Prostata- und Lungenkrebs zu entwickeln.

LABORWELT:

Wohin geht die Entwicklung?

Dolznig:

Es gibt derzeit einen großen Hype um Lab-on-a-chip- und Organ-on-a-chip-Modelle, die miniaturisiert sind und eine kontinuierliche Kultur erlauben. Diese Modelle haben großes Innovationspotential. Die Gefahr ist aber, dass die Miniaturisierung zu weit getrieben wird, denn ein humaner Tumor hat eben eine gewisse Ausdehnung. Diese lässt sich in den Systemen nicht simulieren. Ein perfektes Modell ist außer Sichtweite. Wichtig ist es, mehrere Modelle parallel zu nutzen und die richtigen Fragen in den richtigen Testsystemen zu stellen. Wir brauchen aber auf jeden Fall In-vitro-Modelle, die die Metastasierung gut nachstellen. Denn nicht Primärtumore, sondern Metastasen sind die Ursache für 90% der Krebstodesfälle. Um organotypische Zellmodelle zu entwickeln, müssen Onkologen, Zellbiologen und Experten für das Tissue Engineering enger zusammenarbeiten. Ich glaube, wir könnten durch die Verbindung von Tumorbiologie, Stammzellbiologie und Tissue Engineering in zehn Jahren soweit sein, komplexe (normale) Gewebe mit 3D-Printern zu drucken und in diese metastasierende Zellen auszusäen, um mehr über die Treiber der Metastasierung zu lernen und zugleich Wirkstoffe zu finden, die diese bremsen oder auf das Metastasenwachstum abzielen.

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4/2014

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