Thema:

Einführung

Zellbasiertes Screening: Lieber 3D- als 2D-Assays?

Der Weg von der Identifizierung eines krankheitsrelevanten Signalweges bis hin zu einem fertigen Medikament ist teuer, langwierig und voller Hürden. Kumulierten Kosten von einer Viertelmilliarde Euro und Entwicklungszeiten von durchschnittlich zehn bis zwölf Jahren steht eine für Arzneimittelentwickler stets zu geringe Erfolgsquote gegenüber – aus dem Primärscreening von einer Million Naturstoffen geht durchschnittlich nur ein einziges Medikament hervor. Der Zwang zu größerer Wirtschaftlichkeit fördert den immer häufigeren Einsatz von zellbasierten Testsystemen in der Pharmaindustrie. Grund: Die vor allem im frühen Entwicklungsprozess eingesetzten zellbasierten Testsysteme gestatten einen höheren Durchsatz als die klassischen Tierversuche und bieten dadurch eine ethisch unbedenkliche und zugleich wirtschaftliche Alternative zu Tiermodellen, wo diese ersetzt werden können. Rund um die Analyse von Signalwegen, der Zellproliferation und der Rezeptorwirkung hat sich ein wachsender Markt entwickelt, dem konservative Marktforscher ein jährliches Wachstum von rund 10% auf rund 1,6 Mrd. US-$, waghalsigere auf 4,7 Mrd. US-$ bis 2018 voraussagen.

Neben dem Drug Screening und den präklinischen ADMET-Untersuchungen (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, Toxicity) halten zellbasierte Tests aber auch immer stärker Einzug in Forschungslabore. Denn sie stellen biologische Mechanismen im zellulären Kontext und damit realistischer nach als klassische biochemische In-vitro-Assays. Aktuell stellen die zellbasierten Tests deshalb bereits mehr als die Hälfte aller Hochdurchsatz (HTS)-Assays. Während die klassischen homogenen Rezeptor-Ligand-Bindungsassays aufgrund ihrer Schnelligkeit, Reproduzierbarkeit und geringen Variabilität in HTS-Kampagnen punkten, werden die zellbasierten Tests überall dort eingesetzt, wo potentielle Targets nicht zufriedenstellend aufgereinigt werden können und gewebespezifisches Verhalten untersucht werden muss.
Gerade zellbasierte Tests zur Vorhersage der akuten Leber-, Nieren- und Herztoxizität sind daher im Aufwind. Sie sind billiger und schneller als Tierversuche. Erste Erfolge bei der Identifizierung aussagekräftiger Biomarker, die nierenschädigendes Potential präklinischer Wirkstoffe anzeigen, meldet etwa das „Predictive Safety Testing Consortium“ (PSTC), eine Initiative der FDA, EMA und Nephrotoxic Working Group (NWG). Sieben Biomarker wurden gefunden, sechs im sogenannten KidneyMAP-Test kommerzialisiert – der Multiplex-Immuntest zeigt arzneimittelinduzierte Nierenschäden in Rattenzellmodellen sowie in humaner Zellkultur an.
Ob sich indes zellbasierte Modelle finden lassen, um systemische toxikologische Endpunkte vorherzusagen – wie die Toxizität bei wiederholter Gabe, Karzinogenität und Reproduktionstoxizität –, ist derzeit offen, wenngleich dies im Rahmen des bis 2016 laufenden EU-Projektes Detective (Detection of endpoints and biomarkers for repeated dose toxicity using in vitro systems) versucht wird www.detect-iv-e.eu).
Zwar zeichnen aktuelle Forschungsergebnisse bereits den Weg in der Assay-Entwicklung vor – hin zu Tests, die immer besser den physiologischen Kontext abbilden. Doch sind vor ihrer Etablierung derzeit noch wichtige technische und wirtschaftliche Hürden zu überwinden.

Wahl und Kultur der Zelllinie

Grundsätzlich werden zellbasierte Hochdurchsatzanalysen derzeit meist in zweidimensional gewachsenen Zellverbänden in Multiwellplatten durchgeführt und die Messergebnisse optisch oder amperometrisch erfasst. Bei der Auswahl der eingesetzten Zelllinie spielen Kosten und Komfortabilität derzeit eine große Rolle: Immortalisierte Zelllinien wie Hek-Zellen, die oft zum Screening von Neurotransmitter-Agonisten genutzt werden, sind zwar kaum repräsentativ für native Zellen, wachsen aber homogen und lassen sich gut auslesen. Physiologisch näher an der In-vivo-Situation sind dagegen primäre Zellen, wie etwa humane T-Zellen, die zum Screening von HIV-Blockern eingesetzt werden. Gleichwohl müssen sie frisch präpariert werden und liefern nur wenig reproduzierbare Ergebnisse. Wichtige Nachteile zeigt auch das NCI-60-Panel, eine Zusammenstellung von 60 repräsentativen Tumorzelllinien, die zum Screenen von Krebsarzneien eingesetzt werden: Sie enthalten Mutationen, die sich negativ auf die Screeningergebnisse auswirken können.

Als Alternativen rücken deshalb zunehmend humane Krebsstammzellen, embryonale Stammzellen (hESCs) sowie induziert pluripotente Stammzellen (iPSCs) in den Fokus. Da noch unklar ist, inwiefern aus ihnen differenzierte Zellen native Zellfunktionen repräsentieren, laufen derzeit innerhalb der Innovative Medicines Initiative (IMI) Bemühungen, standardisierte, möglichst homogene iPSC-Zelllinien herzustellen (vgl. LABORWELT 3/2013). „iPSC-basierte Zellmodelle können bereits jetzt bestimmte Aspekte einer Krankheit nachstellen,“ so Martin Graf, Koordinator des StemBancc-Projektes bei der Baseler Roche AG. Standardisierte iPSC-Zelllinien bieten trotz hoher Erhaltungskosten und noch zu geringer Ausbeute den Vorteil, ausreichende Zellmengen für Screenings und Toxizitätsstudien bereitzustellen. Zudem lassen sie sich in beliebige, sonst nicht vermehrbare Gewebe differenzieren, die die Krankheit des individuellen Patienten repräsentieren. Funktionelle RNAi-Screens so standardisierter Zelllinien eröffnen einen molekularen Einblick in das Krankheitsgeschehen und die daran beteiligten Moleküle und Signalnetzwerke in humanen Zellen. Die IMI setzt auch in ihrem zweiten Arbeitsprogramm auf zellbasierte Methoden, um toxische und wirkungslose Medikamentenkandidaten auszusortieren.

3D-Kulturen besser als 2D-Kulturen?

Eine noch bessere Simulation der Situation im Gewebe versprechen dreidimensionale Zellkulturen. Neben der natürlichen Zellmorphologie stellen die Zellhaufen (Sphäroide) die in natürlichem Gewebe vorhandenen Zell-Zell-Kontakte und Zell-Matrix-Wechselwirkungen besser dar als zweidimensionale Kulturen – oft mit bedeutenden Auswirkungen auf die Messergebnisse. „Die klassische zweidimensionale Zellkultur spiegelt die Situation im lebenden Organismus zu wenig wider“, so Ursula Graf-Hausner, Chefin des Kompetenzzentrums für künstliche Gewebe zur Wirkstoffprüfung und Medikamenten­entwicklung an der Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften. Dreidimensional kultivierte Darmkrebszellen zeigen, verglichen mit 2D-Kulturen, etwa eine 180-fach stärkere Arzneimittelresistenz. Auf 3D-Darmkrebssphäroide wirkt das Chemotherapeutikum Gemcitabine rund 1.000-fach weniger zytotoxisch, wogegen Tests in 2D-Kultur nahelegen, dass der Wirkstoff Tumore im Menschen effektiv abtötet. Zudem lassen sich durch Kokultur von Tumor­epithelzellen mit dem sie umgebenden Bindegewebe – einem Gemisch aus gesunden Fibroblasten und tumorinfiltrierenden Immunzellen – die für die Metastasierung wichtigen Tumor-Stroma-Interaktionen untersuchen. Wie wichtig die von den Stromazellen ausgeschütteten Botenstoffe sind, zeigt die jüngste Entdeckung eines Teams um Jorge Moscat vom kalifornischen Sanford-Burnham Medical Research Institute.

Die Wissenschaftler berichten, dass Stromazellen, die den antientzündlichen Tumorsuppressor p62 nicht länger bilden, durch verstärkte Interleukin 6-Bildung den Startschuss für den Tumor geben, invasiver zu wachsen und Metastasen zu bilden.

Flaschenhals Detektion

Obgleich 3D-Kulturen das Mittel der Wahl sind,  wenn es um die Analyse der Auswirkungen von Arzneimitteln unter physiologischen Bedingungen geht, stehen ihrem breiten Einsatz so einfache Dinge wie das Fehlen einer etablierten Detektionsmethode entgegen. Elektrochemische Read-out-Verfahren, wie etwa Änderungen des elektrischen Widerstands, eignen sich bei der Zellviabilitätsmessung nur für zweidimensionale Zellrasen, da ein direkter Zell-Elektroden-Kontakt erforderlich ist. Auch der Großteil der oft zur Quantifizierung von GFP-Fusionsproteinen eingesetzten Laser-Scanning-Imaging-Systeme mit angeschlossener quantitativer Bildanalyse-Software ist bis dato wenig geeignet für die Analyse der stark autofluoreszierenden dreidimensionalen Zellkulturen. Imaging-Lösungen, die das Signal-Rausch-Verhältnis verbessern, sind indes derzeit in Entwicklung (J. Biotechnol. doi: 10.1016/j.biotec.2010.11.012).

Ziel: Langzeitbeobachtung von Zellkulturen


Um Langzeitstudien mit Zellen durchführen zu können, ist es nicht nur erforderlich, Analysemethoden zu entwickeln, mit denen sich nicht-invasiv und mehrmals hintereinander messen lässt, sondern die Zellen unter Perfusionsbedingungen anstelle der statischen Bedingungen geschüttelter Mikrotiterplatten zu kultivieren.
Dies reduziert das Risiko von Kontaminationen durch wiederholte Eingriffe in die Zellkultur und vermeidet Variationen durch Medienwechsel im für das Messergebnis wichtigen Mikromilieu. Einen Ausweg könnten Mikrofluidik-Lösungen bieten, die Verdunstungseffekte vermeiden und Automation mit Miniaturisierung verbinden.
Da die Systeme bisher auf Untersuchung von 2D-Zellkulturen beschränkt sind, gibt es hier weiteren Entwicklungsbedarf. Durch den Trend, physiologisch relevante
zellbasierte Modelle in Grundlagen- und Pharmaforschung zu etablieren, ergeben sich
Wachstumschancen für ganz verschiedenartige Anbieter. Neue Pipettier-, Zytometrie- und Mikrofluidiklösungen, Medien und Behälter für die Stammzellkultur, Transfektionsprotokolle sowie Werkzeuge zur gezielten Manipulation humaner Zelllinien (RNAi, CRISPs, ZFNs, TALENs) sind ebenso gefragt wie schonende und empfindliche Markierungs- und Detektionsverfahren.

Mehr zum Spezial

Magazin zum Thema


4/2014

© 2007-2017 BIOCOM

http://www.laborwelt.de/spezialthemen/zellbasierte-assays.html

Alle Themen

SpezialThemen

Produkt der Woche

Alle Produkte

Kalender

Alle Events

Partner-Events

Glasgow (UK)

DIA BioVenture Day

Istanbul (TR)

expomed eurasia