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Blitzlicht

Chemical Screen für die iPS-Reprogrammierung

Die Stammzellforschung ist derzeit wohl eines der spannendsten und vielversprechendsten Gebiete der Lebenswissenschaften. Ergebnisse der Grundlagenforschung könnten in absehbarer Zeit die Grundlage für neue innovative Therapien der regenerativen Medizin und für patientenspezifische Krankheitsmodelle werden. Insbesondere die Nobelpreis-gekrönte Entdeckung der genetischen Reprogrammierung von adulten somatischen Zellen zu sogenannten induziert pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) eröffnet neue und potentiell unbegrenzte Möglichkeiten der Generierung körpereigener Zellen von Patienten. Damit lassen sich einerseits Gewebeunverträglichkeiten bei der Stammzellspende, aber auch ethische Probleme lösen, die etwa bei der Nutzung humaner embryonaler Stammzellen (hESC) entstehen und derzeit unüberwindbar scheinen. 

Prinzipiell hat die iPS-Technologie große Hoffnungen auf eine unbegrenzte Regenerierung kranker Zellen oder auch Gewebe geschürt. Die Technologie verspricht, einen Beitrag zur Bekämpfung bisher unheilbarer Krankheiten zu leisten, wie etwa von neurodegenerativen Erkrankungen, chronischen Entzündungen, Autoimmunkrankheiten sowie Krebs. Zusätzlich bieten die iPS-Zellen bisher unbekannte Möglichkeiten bei der Suche nach neuen Arzneistoffen, denn sie lassen sich als krankheits- und patientenspezifische Zellmodelle in Drug-Discovery-Programmen nutzen. Trotz aller gebotener Vorsicht, keine vorschnellen Hoffnungen wecken zu wollen, hat das Potential der Stammzellen vielfältige Forschungsaktivitäten auf dem Gebiet der modernen individualisierten Medizin generiert.

Kleine Moleküle zur Differenzierung von Stammzellen

Aktuell sind die Reprogrammierung von somatischen Zellen zu iPSCs und die anschließende Differenzierung noch sehr zeitaufwendig und der Einsatz von reprogrammierten Zellen relativ gering. Hinzu kommt, dass derzeit für die Reprogrammierung Fremd-DNA für Stammzellfaktoren in die Zellen eingebracht werden muss, was potentiell risikobehaftet ist. Tatsächlich haben jüngste Studien gezeigt, dass die mit diesen Verfahren generierten iPS-Zellen genetisch instabil sein können und in sich ein Tumor-Risiko bergen. 

Daher unternehmen akademische Forschungsinstitute, die forschende Industrie, aber auch kommerzielle Anbieter enorme Anstrengungen, alternative und effizientere Methoden zu entwickeln. Ein vielversprechender Ansatz ist die Suche nach niedermolekularen Substanzen (engl. small molecules), die Pluripotenz erhalten oder induzieren können (Drug iPS). So konnte in Forschungsarbeiten gezeigt werden, dass Small Molecules spezifisch Gene aktivieren können, und es sind bereits Substanzen bekannt, die die Pluripotenz von Stammzellen erhalten oder die Reprogrammierung von somatischen Zellen verstärken. Die systematische Suche mit automatisierten Hochdurchsatz-Screeningmethoden und der Einsatz umfangreicher Substanzbibliotheken stecken allerdings noch in den Anfängen.

Auch für die gezielte Differenzierung von Vorläuferzellen zu speziellen Zelltypen ist es wünschenswert, niedermolekulare Wirkstoffe nutzen zu können. Dies gilt sowohl für ES-Zellen, adulte Vorläuferzellen als auch für iPS-Zellen. Auch hier steckt die automatisierte Suche nach geeigneten Wirkstoffkandidaten noch in den Kinderschuhen. Eine Herausforderung sind zunächst die Auswahl und die Entwicklung geeigneter Assay-Formate mit der Definition der relevanten Read-outs, die wissenschaftlich sehr hohe Ansprüche stellt.

Ein wesentlicher Hemmschuh für solche Screening-Kampagnen im Hochdurchsatz ist die schwierige und langwierige Zellkultivierung und die Adaptierung der zellbasierten Assays an den automatischen Prozess. Eine logistische Herausforderung ist zum Beispiel der notwendige Medienwechsel in den Screening-Mikrotiterplatten, die eine erneute Zugabe der jeweiligen Substanzen erfordert.

Daher beschränken sich selbst jüngste Stammzell-basierte Screening-Kampagnen bei professionellen Auftragsforschungsinstituten (CROs) bisher auf weniger als 12.000 verschiedene Substanzen.

Screeningstrategie: akademische Expertise und industrieller Prozess 

Aufgrund der Attraktivität des Forschungsgebietes und der offensichtlichen Notwendigkeit engagiert sich der European ScreeningPort (ESP) in verschiedenen Projekten im Bereich Drug iPS und der Differenzierung von iPS- als auch ES-Zellen zu verschiedenen Zelltypen. Dabei kooperiert der ESP mit international renommierten Stammzellforschern im Rahmen von EU- und DFG-Projekten sowie mit Technologieanbietern in gemeinsamen Forschungs- und Entwicklungsprojekten.

Gemäß dem Geschäftsmodell des ESP bringt der akademische Partner dabei die biologisch-medizinische Expertise und die Zellsysteme ein, während der ESP mit seiner Infrastruktur und seinen Substanzbibliotheken die entsprechenden Assays entwickelt und die Screening-Kampagne durchführt.

Grundsätzlich besteht große Erfahrung mit klassischen Target-orientierten (meist biochemischen) Screening-Technologien. In der Vergangenheit wurden etwa Assays zu epigenetisch relevanten Enzymen entwickelt wobei verschiedenste Detektionstechnologien und die Automatisierung genutzt wurden. Entsprechend gängiger Praxis wurden für die Hit-Bestätigung und -Charakterisierung auch zelluläre Sekundär-Assays entwickelt und angewendet. Aktuell stehen beim ESP sowohl für biochemische als auch zellbasierte Screens eine Reihe modernster Technologien sowie eine entsprechende Infrastruktur zur Verfügung.

Für die Suche nach Stammzell-aktiven Substanzen nutzte der ESP in der jüngsten Vergangenheit aber vor allem phänotypische Screens oder Screening-Formate. Anders als beim Target-basierten Screening wird hierbei eine komplexe physiologische Zellantwort genutzt und mit geeigneten Detektionstechnologien gemessen. Dabei kamen sowohl einfache Lumineszenz-Technologien (Reporter-Gen-Assays) als auch das High Content Screening (HCS) zum Einsatz.

Vor allem das HCS bietet für Drug Discovery-Ansätze enorme Möglichkeiten, da bei dieser Bild-basierten Screening-Technologie die Möglichkeit besteht, eine Vielzahl von Parametern gleichzeitig zu bestimmen. So lassen sich zugleich etwa Differenzierungs- und/oder Pluripotenz-Marker in Zellen detektieren, aber auch morphologische Eigenschaften von Organellen, Zellen oder Zell-Populationen (z. B. Stammzell-Kolonien) charakterisieren. 

Projektbeispiele und Performancedaten

An den folgenden Beispielen sollen das Potential von Stammzellen und die vielfältigen Möglichkeiten ihres Einsatzes in Ultra-Hochdurchsatz- (uHTS)- und High Content-Screens (HCS) verdeutlicht werden. Auch die Kombination von uHTS für den Primärscreen und HCS für das Hit-Profiling zur Bestimmung von Dosiswirkungen scheint ein vielversprechender Weg zu sein.

(1)  In einem Verbund-Projekt der Systembio­logie wurde ein Hochdurchsatz-Screen integriert und 250.000 Substanzen auf ihre Wirksamkeit bezüglich Drug iPS untersucht. Dabei kam ein einfaches Zellmodell unter Verwendung von Reportergen-Assays zum Einsatz, mit denen die Transkription von vier relevanten Stammzell-Faktoren getrennt nachgewiesen wurde. Um die Spezifität der Ergebnisse nachzuweisen, wurden rund 500 Hits in einem Reporter-Gen-Counter-Assay getestet sowie ihre Wirksamkeit dosisabhängig mit 11 Verdünnungen im Reportergen sowie in vier korrespondierenden HCS-Assays mit embryonalen Karzinom-Zellen charakterisiert. Mittels Luciferase-Assay wurden dabei 1,5 Millionen Datenpunkte erzeugt, allein die Bild-Daten hatten eine Größe von 2 Terabyte.

(2) In einem HCS-Projekt beinhaltete die Screening-Kampagne einen phänotypischen Primär-Screen bei dem mehr als 23.000 Substanzen getestet wurden. Die Expression wurde sowohl von Pluripotenz- als auch von Differenzierungsmarkern in embryonalen Stammzellen der Maus (mES) nachgewiesen. Das ausgesprochen anspruchsvolle Zellsystem und der Assay wurde vom akademischen Partner (Institut für Stammzellforschung am Helmholtz-Zentrum München) entwickelt. Im HCS wurden sowohl ein endodermaler Differenzierungsmarker sowie der wichtigste Pluripotenzmarker als auch die Morphologie der Zellen und Kolonien detektiert beziehungsweise charakterisiert. Besondere technologische Schwierigkeiten wie der Mediumwechsel mit erneuter Substanz-Zugabe als auch die Herausforderungen einer komplexen Bilderkennung wurden automatisiert gelöst. Durch den Einsatz von weiteren Bioinformatik-Tools konnte für diesen aufwendigen Screen eine Hit-Expansion erreicht und eine Reihe von analogen Substanzen ebenfalls im HCS als Hits bestätigt und charakterisiert werden. 

(3) In Zusammenarbeit mit einer akademischen Forschungsgruppe und dem Hersteller OLink werden dessen moderne Färbemethoden (Proximity Ligation Assay) eingesetzt und an die HCS-Anforderungen angepasst um die Interaktion von Schlüsselmolekülen in Stammzellen zu untersuchen, wobei die Signal-Netzwerke bei der genetischen Reprogrammierung und Differenzierung zu neuronalen Zellen analysiert werden.

(4) Die Charakterisierung von neuronalen Zellen (neurite outgrowth) und Herzmuskelzellen (cardiac hypertrophy) kann mit einem spezifischen HCS-Assay analysiert werden. Dieser Assay wurde auf Basis von humanen iPS-Zellen von dem Partner Cellular Dynamics International hergeleitet und etabliert und steht somit für Drug Discovery-Kampagnen zur Verfügung.

Diese Beispiele zeigen, dass Technologien verfügbar sind, um Stammzellen auch in Screening-Kampagnen einzusetzen und mit den entsprechenden Pluripotenz-Markern in Maus- und humanen-Stammzellen im Hochdurchsatz zu detektieren. 

Sowohl bei einfachen phänotypischen Screens als auch komplexen HCS-Anwendungen bestand in jüngster Vergangenheit die wichtigste Aufgabe des ESP in der Überführung und Anpassung der aktuellen relevanten Forschungsergebnisse in „Screening-taugliche Assay-Technologien“. 

Ein Blick in die Zukunft zeigt, dass zu­sätzlich zu den klassischen, bereits beschriebenen Wirkmechanismen die nächste Generation der Nachahmer-Proteinarzneimittel völlig andere und zum Teil sehr individuelle und produktspezifische Wirkmechanismen hat, für die geeignete Verfahren zur Bestimmung der Bioaktivität entwickelt werden müssen. 

Korrespondenzadresse

Oliver Keminer
European ScreeningPort GmbH
Schnackenburgallee 114
22525 Hamburg
Tel.: +49-(0)40-303764-288
Fax: +49-(0)40-303764 177
oliver.keminer[at]screeningport.com
www.screeningport.com

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