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Artifizieller Aptamer-Schalter

Aptamere erkennen mit hoher Affinität verschiedenste Liganden in und auf Zellen und sind als sogenannte Riboswitches in der Lage, durch Liganden-Bindung deren Funktion zu modulieren. Ein neues, im Oktober vorgestelltes Aptamerkonstrukt reguliert in Säugerzellen die Genexpression abhängig von der Dosis extern zugegebenen Theophyllins.

Aptamere erkennen mit hoher Affinität verschiedenste Liganden in und auf Zellen und sind als sogenannte Riboswitches in der Lage, durch Liganden-Bindung deren Funktion zu modulieren. Ein neues, im Oktober vorgestelltes Aptamerkonstrukt reguliert in Säugerzellen die Genexpression abhängig von der Dosis extern zugegebenen Theophyllins. Um dies zu erreichen, schleusten Ausländer et al. das sogenannte Tet-OFF-System in Säugerzellen ein und konstruierten ein bispezifisches RNA-Molekül, das ein Theophyllin-bindendes Sensor-Aptamer mit einem Tet-Repressor-Aptamer (TetR-Aptamer) vereint, welches in Anwesenheit von Theophyllin das Tet-Transaktivator (tTA)-Protein bindet. Durch die Bindung dissoziiert das DNA-bindende tTA-Protein von dem Tet-Promotor und verhindert damit die Expression des Gens, das unter Kontrolle des Tet-Promotors steht.

LABORWELT:
Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse?

Ausländer:
Wir konnten mit unserer Arbeit zeigen, dass das zuvor in Bakterien verwendete TetR-Aptamer auch in höheren Organismen aktiv ist und dadurch die in Säugerzellen weitverbreiteten Tet-Systeme regulieren kann. In einem nächsten Schritt konnten wir die Aktivität des TetR-Aptamers unter die Kontrolle eines weiteren Aptamers setzen, welches das Medikament Theophyllin bindet. Dieses neuartige, bispezifische RNA-Konstrukt wies sowohl in Säugerzellen als auch im Reagenzglas vergleichbare Eigenschaften auf. Die neue Regulationsmöglichkeit der Genexpression in Säugerzellen stellt einen weiteren, wichtigen Baustein für synthetische Netzwerke dar. 

LABORWELT:
Was hat Sie motiviert, einen Theophyllin-abhängigen artifiziellen Genschalter zu konstruieren?

Ausländer:
In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl an unterschiedlichen Tet-Systemen in Säugerzellen entwickelt, welche meist auf der Proteinebene unterschieden werden können – zum Beispiel ob ein Gen an- oder ausgeschaltet wird. Bisher war die Regulation des Tet-OFF-Systems auf eine Molekülklasse beschränkt und konnte nur mit den Tetracyclin-Antibiotika reguliert werden. Wir wollten die Regulationsmöglichkeiten um ein anderes kleines Molekül erweitern und haben dafür auf RNA-Ebene die Aptamer-Technologie genutzt und das bekannte Theophyllin-Aptamer verwendet. Eine Erweiterung um weitere Liganden-spezifische Sensoraptamere ist in der Zukunft denkbar.

LABORWELT:
Wie sind Sie experimentell vorgegangen?

Ausländer: 
Ein wichtiger Aspekt in der Synthetischen Biologie ist das rationale Design. Durch die logische Zusammensetzung von zwei bekannten RNA-Bausteinen konnten wir ein modulares, bispezifisches RNA-Molekül konstruieren. Dieses Konstrukt besteht aus drei verschiedenen Modulen: Das Sensor-Modul stellt das Theophyllin-Aptamer dar, welches nach Bindung seines Liganden seine Struktur ändert. Dabei wird das über ein Verbindungsmodul verknüpfte Effektor-Modul, das TetR-Aptamer, in einer Weise beeinflusst, dass es seinen Liganden, das tTA-Protein, ebenfalls binden kann. Interessanterweise hat sich herausgestellt, dass die Länge und der Aufbau der Verbindungssequenz das Verhalten des Konstruktes in Säugerzellen signifikant verändert. 

LABORWELT:
Wo liegen die konkreten Anwendungsfelder solcher Schalter?

Ausländer:
Die Konstruktion von komplexen genetischen Netzwerken in Säugerzellen ist eine Zukunftstechnologie, mit der man therapeutische oder biotechnologische Probleme lösen möchte. In diesen synthetischen Netzwerken werden eine Vielzahl an Regulatoren in Reihe oder parallel geschaltet. Deshalb ist man auf die Entwicklung neuartiger Schalter angewiesen, um eine höhere Komplexität zu erreichen. Ein Beispiel ist ein Schalter, der nach Einstrahlung blauen Lichtes ein Peptidhormon aktiviert, das die Insulinproduktion in Typ2-Diabetes-Mäusen anregt. Wir nennen diese Schaltkreise, die den Ausfall bestimmter Funktionen kompensieren, Prothesenetzwerke. Im vergangenen Jahr haben wir erstmals solch ein Netzwerk vorgestellt, das die Blutharnsäure-Konzentration in gichtkranken Mäusen reguliert.

LABORWELT: 
Welche weiteren Anwendungen solcher Riboswitches haben Sie noch im Sinn und wie gehen Ihre Arbeiten jetzt weiter?

Ausländer:
Aptamere können eine Vielfalt verschiedenster Molekülklassen binden und werden deshalb auch als chemische Antikörper bezeichnet. Je nach Funktion des Liganden können Genexpression, Protein-Protein-Interaktionen oder andere wichtige biochemische Prozesse einer Zelle moduliert werden. Ich glaube, dass das mit unserem RNA-Schalter gezeigte Prinzip beispielhaft sein kann für eine Vielzahl an neuartigen Schaltern. Der modulare Aufbau erlaubt es theoretisch, nahezu jedes erdenkliche Aptamer als Effektor- oder Sensor-Modul zu verwenden. In Zukunft möchten wir diese Art RNA-Schalter in synthetische Netzwerke implementieren, wo es zum Beispiel ein Krankheit-relevantes Molekül erkennt und dadurch als Antwort ein therapeutisches Protein aktiviert.

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Heft 6/2011

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http://www.laborwelt.de/spezialthemen/synbio-systembiologie/artifizieller-aptamer-schalter.html

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