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Blitzlicht

Nichtinvasiver Nachweis transplantierter iPSCs

Der Myokardinfarkt als Folge von Erkrankungen der Herzkranzgefäße ist nach wie vor die Haupttodesursache in den industrialisierten Ländern1,2. In den letzten Jahren wurden weltweit mehrere hundert Patienten mit der sogenannten adulten Zelltherapie nach einem Herzinfarkt behandelt3-5. Der bahnbrechende Erfolg blieb jedoch aus, da eine wirkliche Differenzierung der zumeist vom Knochenmark abgeleiteten Stammzellen in Herzmuskelgewebe nicht stattfand und sich daher die Pumpfunktion des Herzens nicht oder nur marginal verbesserte6.

Die im Oktober mit dem Nobelpreis für Medizin bedachte Reprogrammierung humaner somatischer Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) stellt eine extrem vielversprechende neue Option für die Therapie is-chämischer Myokardschäden dar7-9. iPSCs können etwa nach Reprogrammierung aus Hautfibroblasten oder Blutzellen in frühembryonalem Zustand hergestellt und anschließend in Endothelzellen, glatte Gefäßmuskelzellen und schlagende Herzmuskelzellen differenziert werden10-12. Da es sich um körpereigene Zellen handelt, sollten diese iPS-Derivate keiner Abstoßungsreaktion unterliegen. Der klinische Einsatz von iPSC-abgeleiteten Zellprodukten für myokardiale Zelltherapien wird aber noch etwas auf sich warten lassen. Trotz zum Teil dramatischer technischer Fortschritte müssen zunächst methodische Probleme gelöst oder und Risiken minimiert werden. Dies betrifft die Etablierung neuartiger Technologien zur Massenzelkultur und -differenzierung und die Entstehung genetischer Abnormalitäten, das Potential Teratome zu entwickeln sowie die grundlegende Frage, ob transplantierte iPSCs nach myokardialer Transplantation tatsächlich in ausreichendem Umfang funktionstüchtiges Gewebe einschließlich de novo-Myokard und Blutgefäße bilden, die dann auch zu einem nennenswerten klinischen Vorteil führen13. Erwähnenswert sind in diesem Zusammenhang auch applikationsbedingte Limitationen durch die geringen Überlebens-, Einwanderungs- und Retentionsraten applizierter Zellen14-16. Obwohl einige dieser Aspekte in Kleintiermodellen untersucht werden können, sind andere aufgrund der ähnlichen Physiologie und Anatomie nur in präklinischen Großtiermodellen adäquat zu beantworten17.

Verfahren zum Nachweis transplantierter Stammzellen

Bildgebungstechnologien, die für eine longitudinale Detektion von Zelltransplantaten eingesetzt werden, sollten im Idealfall das Überleben transplantierter Zellen, die Zell-proliferation sowie die Verteilung der Zellen im Organismus visualisieren18. Gegenwärtig sind Transgen-basierte Bildgebungsnachweise, die diesen Vorgaben entsprechen, beschränkt auf Biolumineszenzverfahren. Durch die jedoch sehr eingeschränkte Gewebepenetration ist die Biolumineszenztechnologie auf die Anwendung im Kleintiermodell beschränkt19. In Großtiermodellen wurde bisher hauptsächlich die Magnetresonanztomographie mit der Detektion Nanopartikel-markierter Zellen eingesetzt20,21. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens ist jedoch die Tatsache, dass Nanopartikel-markierte Stammzellen nicht von toten Zellen zu unterscheiden sind, die vor ihrem Zelltod Nanopartikel oder frei im Gewebe liegende bzw. Nanopartikel in phagozytierten Makrophagen aufgenommen haben20,21. Ein anderes Verfahren stellt das direkte Zell-Labeling mit Radionukliden dar. Hierbei können Zellen vor der Transplantation mit „18F-2-Fluor-2-desoxy-D-glucose“ (18F-FDG), Indium-111 (111In), „64Cu-Pyruvaldehyd-bis(N4-Methylthiosemicarbazon)“ (64Cu-PTSM) oder „Technetium-99-Hexamethylprophylen-Amin oxin“ (99mTc) inkubiert und anschließend mit nuklearmedizinischen Technologien wie Positronenemissionstomographie (PET) oder der Single-Photon-Emissions-Computertomographie (SPECT) nachgewiesen werden20,21

Direkte Bildgebungsverfahren können jedoch aufgrund der eingeschränkten Halbwertszeiten sowie der natürlichen Elimination des Radiotracers aus den Zellen nicht für einen longitudinalen Zellnachweis eingesetzt werden20,21. Eine andere Strategie verfolgt das indirekte Zell-Labeling, bei dem ein Transgen (z.B. ein Rezeptor) vor der Transplantation in die Zellen eingeschleust wird und sich anschließend durch die Applikation eines radioaktiven Substrates wie Iod oder Technetium mit nuklearmedizinischen Verfahren nachweisen lässt. Kürzlich wurde solch ein Ansatz durch die Überexpression des Natrium-Iodid-Symporters (NIS) beschrieben22. Da die physiologische NIS-Expression im adulten Organismus auf die Schilddrüse, Magenschleimhaut und Speicheldrüse beschränkt ist, wäre diese Anwendung für die Detektion myokardial transplantierter Stammzellen gut geeignet. Klinisch wird die NIS-Expression als Basis für die Schilddrüsenkarzinom-Diagnostik und Therapie von Metastasen durch radioaktive Iodid-Isotop-Applikation eingesetzt22. Die Darstellung des NIS bietet durch das Fehlen der Immunogenität des humanen NIS-Transgens und die Tatsache, dass der nuklearmedizinische Nachweis von Radiotracern wie 99mTc und 123I eine kostengünstige und weitverbreitete Technologie ist, entscheidende Vorteile im Hinblick auf eine klinische Applikation und die longitudinale Detektion von transplantierten Stammzellen.

Methode

Humane iPSCs11 wurden mit dem bizistronischen Vektor pCAG_rNIS_IRES2_Venus_nucmem (NIS = Natrium-Iodid-Symporter, Venus = Fluorenzenzprotein) stabil transfiziert. Die NIS-spezifische Iodid-Aufnahme wurde mit dem Isotop 123I analysiert. Hier zeigte sich ein Plateau nach ca. 90 Minuten. Insgesamt konnte eine rund 100-fach höhere 123I-Anreicherung in den NIS+-iPSCs im Vergleich zu nicht-transgenen iPSC-Kontrollzellen verzeichnet werden. Zudem konnte die komplette Iodid-Aufnahme durch den spezifischen NIS-Blocker Perchlorat inhibiert werden. Das Maximum der 125I-Akkumulation wurde innerhalb von zwei Stunden wieder in das Medium freigegeben. Einbußen der Zellviabilität konnten durch die Inkubation mit dem Radiotracer nicht dokumentiert werden.

Für die in vivo-Versuche wurde bei Schweinen zunächst ein experimenteller Myokardinfarkt durch Ballonokklusion im mittleren Drittel des Ramus interventricularis anterior (RIVA) induziert. Zehn Tage später erfolgte die Durchführung einer SPECT-CT zur Dokumentation des myokardialen Perfusionsdefektes. Die Zellapplikation erfolgte nach dreidimensionalem NOGA-Mapping über einen MyoStar-Applikationskatheter, der über die Arteria carotis retrograd über die Aortenklappe in den linken Ventrikel eingeführt wurde, so dass 123I-prä-markierte NIS+-iPSCs (5 x 107 iPSCs oder 5 x 107 iPSCs co-appliziert mit 5 x 107 humanen mesenchymalen Stammzellen, MSCs) bzw. 123I-prä-markierte NIS-Kontrollzellen endokardial in zuvor definierte Areale im Randgebiet des Infarktes appliziert werden konnten. Postinterventionell erfolgten nach ein bis drei Stunden weitere SPECT-CTs. Hier zeigten sich intensive 123I-Signale im Septum und in der Lateralwand des linken Ventrikels. Wie erwartet konnten im Bereich der transplantierten NIS-Kon-trollzellen (anteriore Wand) keine 123I-Signale detektiert werden (Abb. 1).

Hervorzuheben ist, dass jeweils intensivere SPECT-Signale in den Bereichen dokumentiert wurden, in denen eine Co-Transplantation mit MSCs erfolgte. Dies könnte auf eine verbesserte Retentionsrate der iPSCs im Myokard hindeuten. Die höchste Signalintensität wurde in den ersten Stunden nach der Zellapplikation nachgewiesen und zeigte dann eine kontinuierliche Abnahme; nach 24 Stunden konnte kein Signal mehr detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Histologische Analysen zeigten die Stichkanäle der Zellapplikationen im Myokard. Zudem konnten in den Bereichen, wo NIS+-iPSCs transplantiert wurden, rundliche Zellen mit einem Anteil von Venus+- und OCT4+-Zellen nachgewiesen werden (Abb. 1).

Für den Nachweis transplantierter NIS+-iPSC-Derivative zu späteren Zeitpunkten (5 Tage und 12-15 Wochen nach intramyokardialer Zellinjektion) wurde den Schweinen der Radiotracer 123I intrakoronar über die Koronararterien (RIVA, RCX und RCA) infundiert. Etwa eine Stunde nach der Tracerinjektion erfolgten die SPECT-CTs zur Detektion des resultierenden 123I-Signals. Hier zeigte sich im Herzen nur in den Bereichen ein 123I-Signal, wo neben den NIS+-iPSCs auch die MSCs co-transplantiert wurden. Im Gegensatz dazu konnte kein 123I-Signal in den Bereichen detektiert werden, wo ausschließlich NIS+-iPSCs oder Kontrollzellen transplantiert wurden (Abb. 2).

Die Beobachtung der geringen Retentions- und Überlebensraten transplantierter Zellen stellt ein essentielles Problem der kardialen Zelltherapie dar23-25. Studien haben gezeigt, daß ein Großteil der intramyokardial transplantierten Zellen direkt nach der Zellapplikation durch den Injektionskanal wieder aus dem Herzen gespült wird25,26 oder die initiale Phase nach der Transplantation nicht überlebt24. In vitro-Co-Kulturversuche mit MSCs unter hypoxischen Bedingungen haben in unserer Studie gezeigt, dass MSCs die Apoptoserate der NIS+-hiPSCs signifikant reduzieren können. Es ist jedoch fraglich, ob die anti-apoptotischen Effekte allein für die gesteigerte Traceraufnahme und damit vermehrte Zellretention verantwortlich sind.Wahrscheinlich spielen auch MSC-abhängige Effekte, welche die Zellaggregation fördern und damit das Auswaschen der Zellen verringern, eine entscheidende Rolle. Da jedoch im Langzeitverlauf NIS+-iPSCs ausschließlich in den Bereichen detektiert werden konnten, wo MSCs co-transplatiert wurden, scheint auch ein Langzeiteffekt der MSCs auf die NIS+-iPSCs zu existieren.

In histologischen Untersuchungen konnte ein Einwandern einiger NIS+-iPSCs durch die Detektion Venus+-hiPSC Derivate fünf und 12 bis 15 Wochen nach der Zelltransplantation nachgewiesen werden. Interessanterweise zeigten die iPSC-Derivate nach 12 bis 15 Wochen einen endothelialen Phänotyp. Semiquantitative Analysen zur Kapillardichte zeigten zudem eine gesteigerte Kapillarisierung in den Bereichen, wo NIS+-iPSCs zusammen mit MSCs co-transplantiert wurden. Im Gegensatz zu den frühen histologischen Analysen (5 Stunden nach Zellapplikation) konnten zu den beiden späteren Zeitpunkten (5 d und 12-15 Wochen) keine OCT4+-iPSC Derivate mehr detektiert werden, welches auf eine in vivo-Differenzierung der Zellen hindeutet.

Insgesamt zeigt diese Studie erstmals den Nutzen der transgenen NIS-Expression für die longitudinale in vivo-Detektion des Zellüberlebens, „Engraftments“ und die Verteilung zellulärer humaner iPSC-Derivate durch die Anwendung des klinisch verfügbaren SPECT-CTs in einem präklinischen Großtiermodell. Die angewandten dreidimensionalen Hybrid-Imaging-Protokolle ermöglichen die kombinierte Beurteilung der kardialen Anatomie und myokardialen Perfusion sowie das Monitoring der applizierten Stammzellen mit einer Hybrid-Bildgebungsmodalität. Das entwickelte Bildgebungsverfahren kann zu einer Optimierung Zell-basierter Therapiestrategien beitragen und ist zudem geeignet, potentielle Nebeneffekte einer Therapie mit pluripotenten Stammzellen, wie die Tumor- und Teratom-entwicklung, zu überwachen.

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Korrespondenzadressen

PD Dr. med. Christian Templin
Klinik für Kardiologie, Universitäts-Spital Zürich
Rämistrasse 100, 8091 Zürich, Schweiz
Christian.Templin[at]usz.ch

Prof. Dr. rer. nat. Ulrich Martin
LEBAO-HTTG, Medizinische Hochschule Hannover
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30625 Hannover
Martin.Ulrich[at]mh-hannover.de

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