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Blitzlicht

Drug Testing mit Stammzellderivaten

Die klassische Suche und Validierung von neuen Wirkstoffen zur Bekämpfung menschlicher Krankheiten ist ein ressourcenverzehrender Prozess mit geringer Erfolgsrate. Der Einsatz von Stammzellen könnte zu einer Revolution in der Wirkstoffforschung führen; erste Screenings zeigen das immense Potential dieser Technik. Mit Hilfe der hier vorgestellten Screeningmethode, die auf Stammzellen basiert, konnte das komplexe Zusammenspiel dreier Zelltypen in vitro modelliert werden: Motoneuronen, Astrozyten und Mikrogliazellen. Es ist bekannt, dass diese Zelltypen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) spielen, auch wenn der genaue Mechanismus noch unverstanden ist. Insgesamt konnten so 12 neue Wirkstoffkandidaten entdeckt werden, die neurologische Erkrankungen aufhalten sollen.

Obwohl die Investitionen in Forschung und Entwicklung neuer Medikamente stetig zunehmen, sinkt die Anzahl neu zugelassener Wirkstoffe1. Ein entscheidender Grund dafür ist die Unwirksamkeit oder Toxizität potentieller Arzneistoffe in klinischen Studien. Zudem stellt sich häufig heraus, dass neu entdeckte Drug-Targets doch nicht die entscheidende Rolle im Erkrankungsverlauf spielen, wie zuvor vermutet. Oft ist eine Krankheit auch derart schlecht verstanden, dass weder Mechanismus noch beteiligte Interaktionspartner bekannt sind. In diesen Fällen ist es nahezu unmöglich, nach potentiellen Wirkstoffen zu suchen, die diese Ziele spezifisch regulieren.

Phänotypische Screeningmethoden, die Krankheitsaspekte in vitro modellieren, versprechen die Medikamentenforschung zu revolutionieren. Neue Wirkstoffe werden so in einem Zellsystem mit physiologisch und pathophysiologisch relevanten Prozessen entdeckt, getestet und validiert. Die Herausforderung hierbei ist die Verwendung von Zellen, die erkrankungsrelevante Vorgänge möglichst so widerspiegeln, wie sie auch im Patienten vorzufinden sind. 

Primärzellen wären eigentlich ideal für phänotypische Screenings, da sie die für die Krankheitsentwicklung relevanten Prozesse am besten rekapitulieren. Allerdings werden für High-Throughput-Screening (HTS)-Kampagnen, in denen mehrere Hunderttausend chemische Verbindungen getestet werden sollen, Trillionen von Zellen benötigt. Somit ist es impraktikabel, die erforderlichen Zellmengen aus Tieren zu isolieren; darüber hinaus sind menschliche Primärzellen praktisch nicht verfügbar. Zudem erweisen sich Populationen primärer Zellen oft als inhomogen, was ein robustes Screening erschwert. Zelllinien wie HEK293 oder SH-SY5Y lassen sich zwar expandieren, sind aber transformiert und weisen dadurch im Vergleich zu den Ursprungszellen zum Teil veränderte Eigenschaften auf. Auch neigen Zelllinien zu den unterschiedlichsten chromosomalen Aberrationen, die eine zusätzliche Variable beim Screening darstellen, da sie sich auf das Zellverhalten auswirken können. Hinzu kommt, dass sie krankheitsrelevante Prozesse nur begrenzt widerspiegeln. Der wohl wichtigste Punkt ist aber der, dass die Verwendung von Zelllinien insbesondere dann an ihre Grenzen stößt, wenn Zellen benötigt werden, die sich nicht mehr teilen, wie etwa im Falle ausgereifter Neuronen.

Die einzigartigen Fähigkeiten von Stammzellen machen diese zum idealen Hilfsmittel für phänotypische Arzneimittel-Screenings. Erstens sind sie im Stande, sich unendlich oft zu teilen – eine Eigenschaft, die als Selbst-erneuerung bezeichnet wird. Daher ist es möglich, Stammzellen in großen Mengen zu kultivieren. Zweitens haben sie die Fähigkeit, spezialisierte somatische Zellen zu bilden – diese Eigenschaft nennt sich Differenzierung. So ermöglichen sie die Generierung von großen Mengen homogener differenzierter Zellen, die Primärzellen in vielen Eigenschaften ausgesprochen ähnlich sind. Beispielsweise zeigen aus Stammzellen abgeleitete Neurone typische Verhaltensmuster, wie Aktionspotentiale oder die Ausschüttung von Neurotransmittern. Kombiniert man diese beiden Eigenschaften, erhält man ein universell einsetzbares Werkzeug für phänotypische Screeningprojekte.

In einer immer älter werdenden Gesellschaft steigt die Prävalenz neurodegenerativer Krankheiten wie Alzheimer (Alzheimer’s Disease, AD), Parkinson (Parkinson’s Disease, PD) oder ALS. Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung, in der die Erforschung der Mechanismen dieser Erkrankungen vorangetrieben wurde, fehlen bis dato zugelassene Arzneistoffe, die den jeweiligen Krankheitsverlauf signifikant verzögern oder gar aufhalten können. Zum Beispiel ist derzeit nur ein Medikament gegen ALS zugelassen (Riluzole), welches im besten Fall den Fortschritt der Erkrankung um wenige Monate hinauszögert2.

Neurodegenerative Krankheiten sind unter anderem durch den Verlust von speziellen Neuronensubtypen im Zentralnervensystem (ZNS) gekennzeichnet. Es wird vermutet, dass die fehlerhafte Aktivierung von Mikrogliazellen – den Immunzellen des ZNS – eine entscheidende Rolle in der Pathogenese dieser Erkrankungen spielt, wobei dieser Aspekt am besten für ALS beschrieben ist3. Unter Aktivierung bilden und sekretieren Mikrogliazellen Substanzen, wie etwa Stickstoffmonoxid und Zytokine, die selektiv toxisch auf Nervenzellen wirken. Dieser Phänotyp kann nun mittels Stammzellen in vitro modelliert und analysiert werden, mit dem Ziel neue Wirkstoffe zu entdecken, die das Absterben der Nervenzellen verhindern.

Ergebnisse

In unserer Abteilung wurde ein stammzellbasiertes Modell der Krankheit ALS etabliert (siehe Abb. 1)4. Hierzu wurden drei verschiedene Zelltypen so zusammengebracht, dass sie auf verlässliche Weise die Krankheit widerspiegeln: 1. Motoneurone (MN), die Nervenzellen, die die Bewegungen der Muskeln ansteuern und die bei ALS absterben, 2. Astrozyten, die als Unterstützungszellen dienen, und 3. die Mikrogliazellen.

Unter Verwendung von embryonalen Stammzellen der Maus mit einem Hb9-GFP-Transgen (ein spezifischer Marker für postmitotische MN), konnten effizient und in großen Mengen MN hergestellt, isoliert und später mikroskopisch detektiert werden. Diese wurden auf einem Astrozyten-Monolayer ausplattiert, der sich von neuronalen Stammzellen der Maus ableiten lässt. Da bislang kein Protokoll vorliegt, um Stammzellen in Mikrogliazellen umzuwandeln, und die Isolierung von ausreichenden Mengen Primärzellen nicht realisierbar ist, wurde eine Mikroglia-Zelllinie der Maus verwendet. Diese reagiert vergleichbar wie Primärzellen auf Aktivierung und Zell-Zell-Interaktionen und ist ein akzeptabler Ersatz. Nach Zugabe der mit Lipopolysaccharid und Interferon-γ aktivierten Mikrogliazellen degenerieren die MN innerhalb von 30 Stunden. Die Überlebensrate der MN konnte mittels High-Content-Imaging analysiert und quantifiziert werden (siehe Abb. 2). Für den Einsatz in einem Wirkstoff-Screening mit Tausenden Substanzen wurde ein Analyseverfahren (Assay) im 384-Well-Format etabliert.

In Zusammenarbeit mit der Biotechnologie-Firma Evotec AG wurden ca. 11.000 Substanzen getestet, von denen sich 37 als neuroprotektiv erwiesen (siehe Abb. 2)4. Der nächste Schritt nach Identifikation der aktiven Substanzen war die Entschlüsselung der Mechanismen. Da der Assay aus drei verschiedenen Zellarten mit jeweils unterschiedlichen biologischen Funktionen besteht, kann eine Modulation jeder Zellart allein oder in Kombination den beobachteten Effekt hervorrufen. Um dies herauszufinden, wurden diverse sekundäre Analyseverfahren etabliert, mit denen die 12 vielversprechendsten Substanzen getestet wurden4. Wir konnten zum Beispiel Wirkstoffe identifizieren, die die Entstehung von schädlichen Abbauprodukten verhindern oder die direkt protektiv auf die MN wirken. Eine weitere Substanzgruppe aktivierte den Nrf2-Signalweg, den wichtigsten zellulären Schutzmechanismus gegen oxidativen Stress. Bemerkenswerterweise schützten unsere Nrf2-Aktivatoren die MN durch Modulation der Mikroglia-Aktivierung, statt direkt die Expression von antioxidativen Genen in MN zu regulieren4.

Auch Astrozyten können aktiviert werden, die als Folge für MN toxische Substanzen ausschütten. So verursachen etwa Astrozyten, die eine Mutation im SOD1-Gen (G93A) tragen, ein Absterben von co-kultivierten MN5,6. Eben diese Reaktion gilt als eine Ursache für ALS in Patienten – ein Verhalten, das auch in Mausmodellen reproduziert werden konnte. Durch Zugabe unserer neuen Nrf2-Aktivatoren konnte die Astrozyten-vermittelte Toxizität unterdrückt werden. Interessanterweise erwiesen sich die von uns endeckten, neuen Wirkstoffe als potenter und weniger zytotoxisch als bereits bekannte Nrf2-Aktivatoren4. Dies ist besonders interessant, da diese Substanzklasse bereits als neuroprotektiv in Tierversuchsmodellen für ALS, PD und AD beschrieben wurde7-9 und ihnen daher großes Potential zugesprochen wird, künftig als Arzneistoffe genutzt werden zu können.

Ausblick

Phänotypische Assays haben das Potential, einen Paradigmenwechsel in der Arzneimittelforschung und -entwicklung einzuleiten. Dies gilt im Besonderen für neurodegenerative Erkrankungen, bei denen die klassische Wirkstoffsuche oft versagt und für die in Zukunft ein immer größerer Bedarf an effektiven Medikamenten prognostiziert wird. 

Das hier vorgestellte Testsystem und die zugrundeliegende Plattformtechnologie wird im Kontext der Gründung des translationalen und gemeinnützigen CARE-Institutes (Center for Advanced Regenerative Engineering) in die industrielle Anwendung überführt. Zahlreiche Anfragen von an Arzneimitteln forschenden Unternehmen bestätigen das Potential dieser Technologie und der einhergehenden strategischen Vorteile.

Eine solche Reifung und Überführung in die Klinik, wie sie in CARE durchgeführt werden soll, ist notwendig, da zurzeit die größte Herausforderung darin besteht, die Technologie humaner Stammzellderivate für die industrielle Anwendung zu etablieren. Weltweit wird daher fieberhaft an der Optimierung von neuen Differenzierungsprotokollen gearbeitet, um verschiedenste Erkrankungen in vitro modellieren zu können. Zudem ermöglicht die bahnbrechende Entdeckung der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)10, für die Shinya Yamanaka mit dem diesjährigen Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet worden ist, eine Implementierung von patientenspezifischen Zellen in Screening-Kampagnen. So ermöglichen sie auch Experimente an Erkrankungen ohne bekannten genetischen Hintergrund, die zu neuen Wirkstoffen und zum Verständnis der Pathogenese beitragen können. 

Literatur

1. Swinney DC, Anthony J (2011) How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov 10, 507-519.
2. Miller RG, Mitchell JD, Lyon M, Moore DH (2003) Riluzole for amyotrophic lateral sclerosis (ALS)/motor neuron disease (MND). Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord 4, 191-206.
3. Boillée S, Yamanaka K, Lobsiger CS, Copeland NG, Jenkins NA, Kassiotis G, Kollias G, Cleveland DW (2006) Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science 312, 1389-1392.
4. Höing S, Rudhard Y, Reinhardt P, Glatza M, Stehling M, Wu G, Peiker C, Böcker A, Parga JA, Bunk E, Schwamborn JC, Slack M, Sterneckert J, Schöler HR (2012) Discovery of inhibitors of microglial neurotoxicity acting through multiple mechanisms using a stem-cell-based phenotypic assay. Cell Stem Cell 2012 Oct 10, doi: 10.1016/j.stem.2012.07.005 [Epub ahead of print].
5. Marchetto MC, Muotri AR, Mu Y, Smith AM, Cezar GG, Gage FH (2008) Non-cell-autonomous effect of human SOD1 G37R astrocytes on motor neurons derived from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 3, 649-657.
6. Nagai M, Re DB, Nagata T, Chalazonitis A, Jessell TM, Wichterle H, Przedborski S (2007) Astrocytes expressing ALS-linked mutated SOD1 release factors selectively toxic to motor neurons. Nat Neurosci 10, 615-622.
7. Jazwa A, Rojo AI, Innamorato NG, Hesse M, Fernández-Ruiz J, Cuadrado A (2011) Pharmacological targeting of the transcription factor Nrf2 at the basal ganglia provides disease modifying therapy for experimental parkinsonism. Antioxid Redox Signal 14, 2347-2360.
8. Li XH, Li CY, Lu JM, Tian RB, Wei J (2012) Allicin ameliorates cognitive deficits ageing-induced learning and memory deficits through enhancing of Nrf2 antioxidant signaling pathways. Neurosci Lett 514, 46-50.
9. Neymotin A, Calingasan NY, Wille E, Naseri N, Petri S, Damiano M, Liby KT, Risingsong R, Sporn M, Beal MF, Kiaei M (2011) Neuroprotective effect of Nrf2/ARE activators, CDDO ethylamide and CDDO trifluoroethylamide, in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Free Radic Biol Med 51, 88-96.
10. Takahashi K, Yamanaka S (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Hans R. Schöler
MPI für molekulare Biomedizin
Tel: 0251 70365300
Fax: 0251 70365399
office[at]mpi-muenster.mpg.de

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