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Blitzlicht

Industrialisierung der iPSC-Herstellung

Induziert pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen, iPSZ, engl. iPSC) bieten, wie embryonale Stammzellen, die Möglichkeit, definierte somatische Zelltypen in praktisch unbegrenzter Zahl in vitro zu erzeugen. Für Erkrankungen des Nervensystems und des Herzens ist dieser Ansatz besonders relevant, da für diese Gewebe bislang keine patienten- und krankheitsspezifischen Zellquellen für die Medikamentenentwicklung zur Verfügung standen. Die iPS-Zelltechnologie eröffnet erstmals faszinierende Perspektiven, Wirkstoffe für die Behandlung neurodegenerativer oder kardialer Erkrankungen direkt in einem menschlichen Zellsystem zu testen und zu validieren. Langfristig könnten iPS-Zell-basierte Nerven- und Herzmuskelzellen auch eine autologe Quelle für den Zellersatz in diesen nicht regenerativen Geweben liefern. Voraussetzung dafür ist die Erzeugung großer Mengen an iPS-, Nerven- und Herzmuskelzellen in standardisierten, industriellen Formaten. In dem Projekt StemCellFactory verbindet sich das wissenschaftliche und technologische Fachwissen führender Institute und Firmen auf den Gebieten Stammzellforschung und Ingenieurwissenschaften in Nordrhein-Westfalen (NRW) mit dem Ziel, ein automatisiertes System für die industrialisierte Produktion dieser Zelltypen zu entwickeln.

Die diesjährige Verleihung des Medizin-Nobelpreises an Shinya Yamanaka, den Erfinder der iPS-Zelltechnologie, sowie die weltweit bereits laufenden klinischen Studien zum Einsatz von Stammzellen in der regenerativen Medizin verdeutlichen das zunehmende Marktpotential Stammzell-basierter Produkte1. Eine der Nutzungsoptionen von pluripotenten Stammzellen zielt auf die Etablierung neuer Untersuchungs- und Testverfahren ab, die zum einen den Einsatz von Tierversuchen durch die Verwendung von humanisierten zellulären Testsystemen reduzieren, zum anderen die Vorhersage der Wirksamkeit von neuen Wirkstoffen in der präklinischen Phase erhöhen. Dieser Ansatz hat insbesondere durch das Aufkommen der iPS-Zelltechnologie großen Auftrieb erhalten. Die Fortschritte der Stammzellforschung erlauben es nun, zum Beispiel Hautzellen durch Expression von spezifischen Transkriptionsfaktoren zu reprogrammieren und mit Stammzelleigenschaften auszustatten2. Es eröffnet sich dadurch erstmals die Möglichkeit, humane Zellprodukte in gewebe-, krankheits- und patientenspezifischer Form herzustellen und Wirkstoffe direkt an Patientenzellen zu entwickeln. Eine wesentliche Voraussetzung für den Einsatz von iPS-Zell-basierten Krankheitsmodellen sind industrielle Methoden, mit deren Hilfe sich große Mengen an iPS- Zellen und davon abgeleiteten gewebespezifischen Zellen in gleichbleibender Qualität erzeugen lassen. 

Durch den hohen Grad an komplexen Handhabungsschritten wurde bisher kein industrieller Prozess entwickelt, der den Bedarf an humanen Stammzell-basierten Zellprodukten zur Erforschung neuer Wirkstoffe zufriedenstellend bedient. Insbesondere fehlt die Adaptation dieser Modelle an industrielle Formate und automatisierte Prozessabläufe, um diese in der Medikamentenentwicklung im großen Maßstab einsetzen zu können. Daraus ergibt sich eine deutliche Technologielücke, die wir durch die Entwicklung eines integrierten, automatisierten Produktionsprozesses schließen wollen. Das Vorhaben beinhaltet die Automatisierung, Standardisierung und Parallelisierung aller erforderlichen Arbeitsschritte der Zellkultur zur Reprogrammierung somatischer Zellen in iPS-Zellen sowie deren Expansion und Differenzierung in Nerven- und Herzmuskelzellen (www.stemcellfactory.de). Die multidisziplinäre Zusammenarbeit von Firmen und akademischen Forschungsinstitutionen unter der Leitung der LIFE&BRAIN GmbH und des Instituts für Biomedizinische Technologien am Universitätsklinikum Aachen (RWTH Aachen) vereint die dazu notwendigen Expertisen in Stammzellforschung (Universitätsklinikum Bonn, Max-Planck-Institut für Molekulare Biomedizin, RWTH Aachen), Bioprozessentwicklung (Bayer Technology Service GmbH), Qualitätsmonitoring (AICES), Konstruktion von Prototypen und Anlagemodulen (Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik, HiTec Zang GmbH) sowie der industriellen Herstellung von Zellprodukten (LIFE&BRAIN).

iPS-Zellen – Herausforderung an die industrielle Produktionstechnologie 

Eine besondere Herausforderung ist die Etablierung von Hochdurchsatzverfahren zur Isolation und Analyse einer möglichst großen Zahl von patienten- und/oder krankheitsspezifischen iPS-Zellpopulationen inklusive einer entsprechenden Qualitätskontrolle. Insgesamt erfordert eine Übertragung aller Laborprozesse zur Reprogrammierung, Selektion, Expansion und Differenzierung auf einen automatisierten Anlagenprototypen innovative Lösungen für das Prozess- und Anlagenlayout3. Dabei greift die StemCellFactory auf die breite Erfahrung mehrerer Partner im Bereich Laborautomation zurück4. So wurde beispielsweise am IPT jüngst die Entwicklung einer automatisierten Produktionsanlage für künstliche Haut abgeschlossen5,6.  

Zelluläre Krankheitsmodelle für die Medikamentenentwicklung

Ein Schwerpunkt der StemCellFactory liegt auf der kontrollierten Differenzierung von iPS-Zellen in Nerven- und Herzmuskelzellen. Ziel ist es, von neurodegenerativen und kardiovaskulären Erkrankungen betroffene Nerven- beziehungsweise Herzmuskelzellen aus iPS-Zellen entsprechender Patientenkollektive zu gewinnen und als Assay-fähige zelluläre Produkte für die Wirkstoffentwicklung in standardisierter Form anzubieten. Bisher waren dazu komplexe manuelle Differenzierungsprotokolle erforderlich, deren Durchführung zeit-, kosten- und arbeitsintensiv ist. Die StemCellFactory soll eine schnelle und parallelisierte Produktion krankheitsrelevanter Zellpopulationen für die Assay-Entwicklung ermöglichen. Grundsätzlich sind für die industrielle Produktion von Nerven- oder Herzmuskelzellen unterschiedliche Prozessabläufe erforderlich. Zur Gewinnung von Nervenzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen lässt sich eine stabile und selbst-erneuernde neurale Stammzellpopulation (lt-NES®) herstellen7. Diese Zellen sind frei von verunreinigenden pluripotenten Stammzellen, auf klonaler Ebene multipotent und lassen sich in alle drei Hauptzelltypen des Zentralnervensystems (Neurone, Astrozyten und Oligodendrozyten) ausreifen. Aufgrund ihrer Stammzelleigenschaften kann für die Produktion von lt-NES®-basierten, zellulären Testsystemen ein skalierbarer Produktionsablauf auf der Ebene der lt-NES®-Zellen etabliert werden, was eine enorme Zeitersparnis und Standardisierung bedeutet. Da bisher keine stabile Intermediärpopulation von Herzvorläuferzellen gewonnen werden konnte, muss für die Gewinnung ausreichender Mengen an Herzmuskelzellen eine Skalierung der Zellproduktion auf iPS-Zellebene implementiert werden. Dies soll durch die Integration entsprechender Bioreaktor-basierter Methoden realisiert werden. 

Voraussetzung für den Einsatz der gewonnenen iPS-Zell-abgeleiteten zellulären Krankheitsmodelle bei der Wirkstoffsuche ist, dass die gewonnen somatischen Zellen tatsächlich molekulare Pathomechanismen menschlicher Krankheiten widerspiegeln. Im Fall vieler neurodegenerativer Erkrankungen ist ein gemeinsames Merkmal die pathologische Prozessierung von Proteinen, die letztendlich zu zellulärer Dysfunktion führt. Am Universitätsklinikum Bonn (UKB) wurden kürzlich Hautzellen von Patienten mit einer erblichen Bewegungsstörung (Machado-Joseph-Krankheit) in iPS-Zellen reprogrammiert, um daraus lt-NES®-Zellen und davon abgeleitete funktionierende Nervenzellen zu generieren. Anhand dieser Nervenzellen konnten die Forscher zeigen, dass die Bildung von krankheitsassoziierten Proteinaggregaten unmittelbar mit der elektrischen Aktivität der gewonnen Nervenzellen zusammenhängt. Eine Schlüsselrolle spielen dabei Calpaine, die durch den erhöhten Kalziumgehalt stimulierter Nervenzellen aktiviert werden. Dieser neu identifizierte Mechanismus erklärt, warum die Erkrankung ausschließlich Nervenzellen betrifft8. In einer anderen Studie demonstrierten die Wissenschaftler, dass sich lt-NES®-Zellen ebenfalls zur Erforschung neuer Therapien bei der Behandlung von Morbus Alzheimer eignen9. Ein Merkmal der Krankheit ist die Bildung sogenannter β-Amyloid-Peptide (Aβ-Peptid), die sich im Krankheitsfall in Form unlöslicher Aggregate insbesondere in der Umgebung von Neuronen im Gehirn ablagern. Entscheidend für die pathologische Situation ist dabei das Verhältnis der Peptide Aβ-42 zu Aβ-40. Die Aβ-Peptide entstehen aus dem Amyloid-Vorläufer-Protein (APP), dessen enzymatische Prozessierung durch sogenannte Sekretasen erfolgt. Es konnte gezeigt werden, dass die entscheidenden Schritte der APP-Prozessierung in Neuronen rekapituliert werden, die aus lt-NES®-Zellen gewonnen wurden. Die Behandlung mit pharmakotherapeutischen Modulatoren wie Sekretase-Inhibitoren oder nicht-steroidalen Antiphlogistika beeinflusste die APP Prozessierung und damit das Aβ-40- zuAβ-42-Verhältnis.

Darüber hinaus verursachte die Expression einer, mit einer familiären Variante der Alzheimerschen Erkrankung assoziierten, Mutation im Presenilin-1-Gen in aus lt-NES®-Zellen gewonnenen Neuronen einen pathologisch veränderten Aβ-42/Aβ-40-Quotienten9. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass aus iPS-Zellen gewonnene humane Neurone einen experimentellen Zugang zu krankheitsassoziierten molekularen Mechanismen bieten und daher für die pharmakologische Wirkstoffsuche von größtem Interesse sind.

Die beschriebenen Befunde stehen in einer langen Reihe aktueller Publikationen, die belegen, dass an Patientengewebe beobachtete Phänomene und Pathomechanismen mit Hilfe IPS-Zell-basierter zellulärer Modelle in vitro abgebildet werden können und verdeutlichen das Potential solcher Modelle für Krankheitsforschung und Therapieentwicklung10-12. Mit dem Ziel, iPS-Zell-basierte zelluläre Krankheitsmodelle in ausreichender Quantität und Qualität automatisiert herzustellen, zielt das Projekt StemCellFactory auf eine Industrialisierung und damit breite Anwendung dieses Ansatzes in Wissenschaft und Industrie ab. 

Stem Cell Factory

http://www.stemcellfactory.de/
LIFE&BRAIN GmbH (LIFE&BRAIN)
Rhein.-Westfäl. Technische Hochschule (RWTH)
Fraunhofer-Institut für Produktionstechnologie (IPT)
Universitätsklinikum Aachen (UKA)
Universitätsklinikum Bonn (UKB)
MPI für Molekulare Biomedizin (MPI)
HiTec Zang GmbH (HiTec Zang)
Bayer Technology Service (BTS)

Literatur

[1] Steven D Schwartz,S.D., Hubschman, JP., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C.K., Ostrick, R.M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanz, R., Lancet 379 (2012), 713–20.
[2] Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S., Cell 131(5) (2007), 861-72.
[3] Haupt, S.; Grützner, J.; Thier, M.; Kallweit, T.; Rath, B.; Laufenberg, I.; Forgber, M.; Eberhardt, J.; Edenhofer, F.; Brüstle, O., Biotechnology and Applied Biochemistry (2012), DOI: 10.1002/bab.1014.
[4] Terstegge, S., Laufenberg, I., Pochert, J., Schenk, S., Itskovitz-Eldor, J., Endl, E., und Brüstle, O., Biotechnol Bioeng 96 (2007), 195-201.
[5] Webpage Tissue Factory: http://www.tissue-factory.com
[6] Walles, H., Pickert, D., Kaufmann, M., GIT Labor-Fachzeitschrift (2011), 552-554
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[8] Koch, P., Breuer, P., Peitz, M., Jungverdorben, J., Kesavan, J., Poppe, D., Doerr, J., Ladewig, J., Mertens, J., Tüting, T., Hoffmann, P., Klockgether, T., Evert, B.O., Wüllner, U., Brüstle, O., Nature 480 (2011), 543–546.
[9] Koch, P., Tamboli, I. Y., Mertens, J., Wunderlich, P., Ladewig, J., Stuber, K., Esselmann, H., Wiltfang, J., Brustle, O., Walter, J., Am J Pathol 180(6) (2012), 2404-16.
[10] Ebert, A.D., and C.N. Svendsen. 2010. Allison D. Ebert1,2, Yu, Y., Rose, F.F., Mattis, V.B., Lorson, C.L., Thomson, J.A., and Svendsen, C.N., Nature 457(2010), 277-280.
[11] Malan D, Friedrichs S, Fleischmann BK, Sasse P. Circ Res. 2011 Sep 30;109(8):841-7. 
[12] Yazawa, M., Hsueh, B., Jia, X., Pasca, A.M., Bernstein, J.A., Hallmayer, J., and Ricardo E. Dolmetsch, Nature 471 (2011), 230.

Korrespondenzadressen

Oliver Brüstle
LIFE&BRAIN GmbH und Institut für Rekonstruktive Neurobiologie
Life & Brain Center
Universität Bonn & Hertie-Stiftung
Sigmund-Freud Straße 25, 53127 Bonn

Martin Zenke
Institut für Biomedizinische Technologien – Zellbiologie,Universitätsklinikum der RWTH Aachen und Helmholtz-Institut für Biomedizinische Technik, RWTH Aachen
Pauwelsstraße 30, 52074 Aachen

Ulrich Marx
Fraunhofer-Institut für Produktionstechnologie IPT
Steinbachstraße 17, 52074 Aachen

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