Thema: Proteomik

Blitzlicht

Verbesserte Triangulation für die 2D-Gel-Auswertung

Durch die Einführung eines Referenzpunktgitters in die 2D-Elektrophorese gelingt eine deutlich verbesserte Koordinatenbestimmung von Proteinspots in der Auswertung von 2D-Gel-Mustern. Das Referenzgitter wird erzeugt durch fluoreszenzmarkierte Markerproteine, die in regelmäßigen Abständen aufgetragen werden und gleichzeitig mit der Probe laufen, die mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist und nach der Elektrophorese bei einer anderen Wellenlänge detektiert wird. Durch die Referenzpunkte wird die Genauigkeit der Spotlokalisierung um eine Größenordnung verbessert.

Die 2D-Elektrophorese ist die Protein-Separationsmethode mit der mit großem Abstand höchsten Auflösung – und der Fähigkeit, aus komplexen Proteingemischen tausende von „Proteinspots“ darzustellen. Hierbei wird die Technik der eindimensionalen isoelektrischen Fokussierung mit der Technik der eindimensionalen SDS-PAGE kombiniert, also die Trennung nach dem isoelektrischen Punkt mit der von der Molekülgröße abhängigen Trennung in der SDS-PAGE. Zur Auswertung der 2D-Gele werden heute in fast allen Fällen die Proteinspotmuster als Bild erfaßt und die XY-Koordinaten der Spots mit geeigneter Software trianguliert.

Das Problem der Vergleichbarkeit

Um einen Vergleich der Muster verschiedener Gele zu ermöglichen, werden sie „normalisiert“ und übereinandergelegt. Nach der Bildbearbeitung werden dann die Spots ausgewählt, die weiter analysiert werden sollen. Die Spots werden ausgestochen, die Proteine im Gel enzymatisch verdaut und die Peptide dann im Massenspektrometer analysiert. Eine durch Triangulation bestimmte XY-Koordinate der Proteinspots ist bei der Auswahl der zu analysierenden Spots eine wichtige Voraussetzung. Je genauer die XY-Positionen bestimmt werden können, desto zuverlässiger lassen sich auch verschiedene 2D-Gele miteinander vergleichen. Ein grundsätzliches Problem bei der Auswertung von 2D-Gelen sind die technischen Gel-zu-Gel-Variationen, die durch unterschiedliche Probenvorbereitung, Herstellung der Gele und Durchführung der Elektrophorese entstehen. Eine wesentliche Verbesserung der Reproduzierbarkeit wurde durch die Einführung des Markierens von Proben mit Fluoreszenzfarbstoffvarianten, die bei unterschiedlichen Wellenlängen detektiert werden, erreicht( Multiplexing DIGE).

Genauer durch Rasterfahndung

Einen weiteren wichtigen Schritt zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Gel-Auswertung stellt die hier vorgestellte „Comparative 2D Fluorescence Gel Electrophoresis“ (CoFGE) dar, die von Simone König und ihrer Arbeitsgruppe am IZKF der WWU in Münster entwickelt wurde.

Durch das Einbringen sehr vieler Triangulationshilfspunkte in das Gel erlaubt eine CoFGE eine wesentlich präzisere XY-Koordinatenzuordnung. Dazu läßt man, gleichzeitig mit dem IPG-Strip mit der zuvor fokussierten und damit in der 1. Dimension aufgetrennten Probe, fluoreszenzmarkierte Proteinmarkergemische in der SDS-PAGE der 2. Dimension laufen. Die Markerproteine werden in regelmäßigen Abständen auf das SDS-Gel aufgebracht. Bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen werden die Probe und die Markerspuren gescannt und die beiden erzielten Bilder in einer Falschfarbendarstellung kombiniert. Der Proteinstandard enthält eine Reihe reiner Proteine von unterschiedlichem Molekulargewicht, die eine reproduzierbare „Kette“ von Markerpunkten darstellt, die – bei Einhaltung eines immer gleichen Auftragsabstandes – ein Referenzgitter für die Gel-Auswertung ergibt. Während bei der klassischen 2D-Gel-Auswertung die Proteinspots immer über die gesamte Gelfläche berechnet werden müssen, wird bei der CoFGE-Technik das Gel in bis zu 100 kleine Triangulationsfelder aufgeteilt, die eine wesentlich genauere und vergleichbarere Berechnung ermöglichen. Dabei werden die ermittelten Markerpunkte und das resultierende Raster zuerst normalisiert und rechnerisch in ein Idealraster umgerechnet, danach das Proteinspotmuster an das Idealraster angeglichen. Dadurch erreicht man, dass alle technischen Variationen, die durch Probenbehandlung und Gelelektrophorese entstehen, ausgeglichen werden.

Verneigung gegenüber Mercator

Die Technik läßt sich sowohl für die weitverbreiteten Vertikalgele als auch für die horizontale SDS-PAGE einsetzen. Die Firma SERVA Electrophoresis GmbH hat in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe König ein spezielles Fertiggel für die horizontalen HPE-Elektrophorese-Systeme entwickelt. Die Gele haben vorgefertigte Aufgabeslots für den markierten Proteinstandard und den IPG-Strip aus der 1. Dimension. In Anlehnung an die Einführung der Meridianlinien in der Kartographie durch den Duisburger Gerd de Kremer, genannt Mercator, erhielten die Gele den Namen „Mercatorgele“. Die Gele und ein fluoreszenzmarkierter Proteinstandard zur Darstellung des Referenzgitters sind bei SERVA erhältlich.

Kontakt:

Günter Theßeling
SERVA Electrophoresis GmbH
Carl-Benz-Straße 7
69115 Heidelberg
guenter.thesseling[at]serva.de

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