Thema: Proteomik

Interview

3D-Modelle: Physiologisch, aber herausfordernd

In einer Rekordzeit von einem Jahr zwischen dem Start der Versuche und der Publikation im Fachmagazin Science haben Forscher von Cellzome eine neue Methode zur Identifizierung von Off-targets etabliert. Für Wirkstoffentwickler ist dieses Wissen Gold wert, scheiden doch viele Wirkstoffkandidaten im Laufe der Entwicklung durch ungewünschte und unerwartete Nebenwirkungsprofile aus. Die Heidelberger kombinierten für ihr „Thermal Proteome Profiling“  (TPP) ihre Massenspektrometrie-Expertise mit einer 20 Jahre alten Methode zur Bestimmung der Proteinstruktur. Der Clou an TPP: Es funktioniert auch mit lebenden Zellen.

LABORWELT:

Cellzome bezeichnet sich als Spezialist für chemische Proteomik. Was verbirgt sich hinter dieser Forschungsrichtung?

Drewes:

Die chemische Proteomik analysiert die Wechselwirkungen von Proteinen in Organismen mit Chemikalien wie Arzneimitteln, Nährstoffen und Giften. Uns bei Cellzome interessieren natürlich insbesondere Wirkstoffe und deren Zielstrukturen auf und in der Zelle, die sogenannten Targets. Auf der Seite der Wirkstoffe erforschen wir vor allem zwei Parameter, das „target engagement“ und die „target occupancy“. Bei ersterem gilt es, in Zellen, im Tiermodell oder in den ersten klinischen Studien am Menschen zu beweisen, dass der Wirkstoff sein Ziel erreicht. Das ist oft nicht trivial und auch bei zugelassenen Wirkstoffen fehlt manchmal dieser Nachweis. Letzterer ist ein quantitativer Parameter: Wie viel Prozent der Zielstrukturen sind bei den verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen belegt? Wie muss ich somit den Wirkstoff dosieren, um für eine bestimmte Zeit eine Rezeptorbelegung von 100% zu erreichen? Beide Parameter sind sehr wichtig, um die Wirksamkeit und die Nebenwirkungen eines Wirkstoffkandidaten klar abschätzen zu können.

LABORWELT:

Und auf der Seite der Targets?

Drewes:

Hier geht es vor allem um die Identifizierung und Validierung dieser Wirkstoffziele. Zum Beispiel ist oft für eine Substanz nicht klar, wo genau sie einen therapeutischen Effekt verursacht beziehungsweise wo sie an ungewünschte oder nicht beabsichtigte Wirkstoffziele bindet und somit sogenannte Off-target-Effekte, also Nebenwirkungen, verursacht. Bei der Validierung geht es eher darum sicherzustellen, dass das festgemachte Target auch wirklich das beste für die gegebene Indikation ist.

LABORWELT:

Welche Probleme haben Wirkstoffentwickler, wenn sie mögliche Off-target-Effekte einschätzen sollen?

Drewes:

Zum einen kennt man in einem frühen Stadium des Projektes diese Off-targets gar nicht. Die am weitesten verbreitete Methode in der Industrie ist derzeit die target-basierte Wirkstoffentdeckung. Hier beginnt man mit einem definierten Target, macht dann einen Hochdurchsatzscreen mit einer Substanzbibliothek und erhält Kandidatensubstanzen. Diese werden dann mittels biochemischer Assays darauf getestet, ob sie das gewünschte Target binden und modulieren können. Für verwandte Off-targets einer Klasse von Zielstrukturen, wie zum Beispiel den Kinasen, gibt es kommerziell erhältliche Panels, mit denen man auch den Einfluss des Kandidaten überprüfen kann. Problematisch ist, wenn mögliche Off-targets anderen Klassen von Zielstrukturen angehören. Diese werden im Allgemeinen nicht entdeckt. Hier stellt sich oft erst in der späteren präklinischen Entwicklung heraus, dass die Substanz toxisch ist.

LABORWELT:

Mit welchen Methoden wird denn derzeit nach solchen Off-targets gesucht?

Drewes:

Aktuell arbeiten Wirkstoffentwickler vor allem mit Zellkulturverfahren, bei denen entweder die Targets oder die Wirkstoffe mit einem Farbstoff markiert sind. Damit wird aber wahnsinnig stark ins System eingegriffen. Zum Teil entfernt man sich da gleich meilenweit von der therapeutischen Anwendung. Cellzome hat bisher vor allem auf die „Kinobeads“-Technologie gesetzt. Das ist eine mittlerweile ausgereifte, quantitative Methode. Mit ihr können viele Zielstrukturen in ein, zwei Versuchen durchgetestet werden. Mittels einer Hilfs- oder Toolsubstanz, die dem zu untersuchenden Wirkstoff ähnelt, werden die entsprechenden Zielstrukturen aus einem Zelllysat isoliert. Diese Substanz ist im Allgemeinen mit einem Linker verbunden, so dass sie via Biotin an ein Bead gekoppelt und immobilisiert werden kann. Die Analyse der isolierten Proteine erfolgt mittels Massenspektrometrie. Ein Nachteil ist jedoch: Die Suche nach solchen Toolsubstanzen ist aufwendig. So muss sichergestellt werden, dass die Ködersubstanz sich ähnlich verhält wie der eigentliche Wirkstoff. Der zweite Nachteil: Diese Methode lässt sich nur auf Zellextrakte anwenden, nicht aber auf lebende Zellen oder Gewebe. Insofern ist es ein Stück weit eine „künstliche“ Situation.

LABORWELT:

Einen entscheidenden Schub hat die Forschung vor etwa einem Jahr durch einen Impuls vom Karolinska-Institut in Stockholm bekommen. Was haben die Schweden gemacht?

Drewes:

Pär Nordlund hatte die geniale Idee, dass man auch von lebendigen, intakten Zellen sogenannte Thermal Shifts aufnehmen kann. Diese Methode gibt es seit 20 Jahren. Sie ist sehr simpel und benötigt vor allem keine Markierung mit Farbstoffen: Für ein gegebenes Protein wird bei verschiedenen Temperaturen die thermische Stabilität gemessen – mit und ohne Anwesenheit des Wirkstoffs. Die Erhitzung dauert dabei nur etwa eine Minute. Bindet der Wirkstoff, ändert sich die thermische Stabilität, was als Änderung in der sogenannten Schmelzkurve deutlich wird. Bisher ist das für einzelne, isolierte Proteine gemacht worden. Nordlund hat das Prinzip auf intakte Zellen angewendet und das Ergebnis – die denaturierten Proteine – via Western Blot verfolgt. Sein Cellular Thermal Shift Assay, kurz CETSA, wurde im Juli 2013 veröffentlicht [Science, 10.1126/science.1233606, d. Red.].

LABORWELT:

Und welche Auswirkungen hatte das auf Cellzome?

Drewes:

Vorher hatten wir keinen Kontakt mit Nordlunds Gruppe. Sofort nach Veröffentlichung der Publikation haben wir erkannt, dass das ein komplett neuer Ansatz ist, der komplementär zu den bei Cellzome praktizierten Methoden ist. In vielen Feldern hat die neue Technologie das Potential, die Kinobeads-Methode abzulösen. Allerdings unter einer Bedingung: Es musste gelingen, den CETSA-Assay mit Proteomik-Methoden zu kombinieren, insbesondere mit der Massenspektrometrie. Nordlunds Methode war ja nicht ergebnisoffen. Da die Detektion mittels Western Blots erfolgte, musste immer der dem Protein entsprechende Antikörper eingesetzt werden. Für eine genaue Quantifizierung benötigt man darüber hinaus auch noch sehr selektive Antikörper, die es aber nur für vergleichweise wenige Targets gibt.

LABORWELT:

Offenbar war Cellzome außerordentlich erfolgreich. Der nächste Science-Artikel wurde ja bereits ein Jahr später publiziert!

Drewes:

Das stimmt! Wir hatten die nun veröffentlichten Versuche zu diesem „Thermal Protein Profiling“ oder kurz TPP in einem halben Jahr erledigt. Das lag zum einen an unserem sehr routinierten, erfahrenen Team. Zum anderen hatten wir die maßgeschneiderten Massenspektrometrie-Proteomik-Methoden griffbereit. So konnten wir sogenannte 10-Plex-Experimente machen. Hierbei werden Proteome oder andere komplexe Proteinmischungen unter zehn Bedingungen verglichen. Bisher nutzte Cellzome die Methode für zehn verschiedene Wirkstoff-Konzentrationen. Auf die CETSA-Methode angewandt haben wir zehn Temperaturen getestet. Die Verknüpfung der Technologien hat perfekt gepasst!

LABORWELT:

Wie haben Sie die Tauglichkeit der neuen Methode demonstriert?

Drewes:

Für die Science-Studie [10.1126/science.1255784, d. Red.] haben wir den Einfluss von Kinase-Inhibitoren auf die löslichen Proteine einer menschlichen Zelllinie untersucht. Die Übereinstimmung mit der etablierten Kinobeads-Technologie war überraschend hoch: So gab es kaum falsch-positive Targets. Allerdings gibt es etliche falsch-negative Funde, das heißt, dass wir mit dem Thermal Profiling ein paar Proteine übersehen, an die die Testsubstanz in Wirklichkeit doch bindet. Es gibt somit Proteine, deren Schmelzkurve sich nicht „shiften“ lässt. Das bedeutet, dass das Thermal Profiling nicht das alleinige Maß aller Dinge zur Bestimmung von Targets ist und eher komplementär zu anderen Methoden eingesetzt werden wird. Wir glauben, dass die Methode vor allem große Proteine – wie Multi-Domänen-Proteine mit vielen verschiedenen Faltungseinheiten – nicht erfasst. Diese lassen sich durch die Bindung einer Substanz einfach nicht genügend stabilisieren. Davon abgesehen konnten wir innerhalb der Studie gleich noch eine zuvor ungeklärte Nebenwirkung eines weit-verbreiteten Kinase-Inhibitors mit beschreiben.

LABORWELT:

Wie kam es dazu?

Drewes:

Für die getestete Natursubstanz Staurosporin hatten wir zunächst herausgefunden, dass dieser Kinase-Inhibitor off-target an eine Ferrochelatase bindet. Dieses Enzym katalysiert einen wichtigen Schritt im Häm-Synthese-Weg. Bei der Recherche zu diesem Protein entdeckten wir schließlich, dass es hier eine Erbkrankheit gibt. Patienten mit einer Mutation im Ferrochelatase-Gen weisen eine erhöhte Fotosensitivität der Haut auf, eine sogenannte Protoporphyrie. Dann erinnerte sich jemand in unserem Team, dass es auch therapeutisch eingesetzte Kinaseinhibitoren mit ähnlichen Nebenwirkungen gibt. Daher lag der Schluss nahe, dass auch diese Wirkstoffe zusätzlich zu ihren therapeutischen Targets an Ferrochelatase binden. Für Vemurafinib – ein Wirkstoff, der für die Therapie der Hautkrebserkrankung malignes Melanom zugelassen ist – konnten wir das mit TPP dann bestätigen.

Auch das therapeutische Target Vemurafinibs, die Kinase B-Raf, wurde natürlich in dem Screen erfasst. Durch den Vergleich zwischen den Schmelzkurven der beiden Targets konnten wir genau das Fenster zwischen den beiden Bindungen bestimmen. Und dieses Fenster ist sehr klein: Die Bindung an die Ferrochelatase erfolgt schon bei einer Konzentrationserhöhung von Vemurafinib um den Faktor 5 verglichen mit der Bindungskonzentration Vemurafinibs an B-Raf. Mit diesem Wissen könnten nun neue Wirkstoffe entwickelt werden, die entweder gar nicht mehr an die Ferrochelatase binden oder zumindest größere Unterschiede in der Bindungsaffinität zwischen den beiden Targets aufweisen.

LABORWELT:

Kann die Methode noch verbessert werden?

Drewes:

Wir können jetzt bis maximal 8.000 Proteine in der Zelle durchsuchen. Es wird aber geschätzt, dass es bis zu 15.000 verschiedene Proteine in einer Zelle gibt. Hier werden wir in Zukunft daran arbeiten, einen immer größer werdenden Teil des Zellproteoms analysieren zu können. Trotzdem wenden wir bei Cellzome TPP schon relativ breit bei vielen verschiedenen therapeutischen Projekten an. Unsere Einschätzung ist, dass TPP in der Zukunft eine der wichtigsten Methoden zur Ermittlung von Wirkstoffzielspektren werden wird. Die Methode kann Wirkstoffentwicklern helfen, schon früh aufs richtige Pferd zu setzen.

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1/2015

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