Thema: Proteomik

Blitzlicht

Proteomik erhellt (Patho-) Physiologie von Bakterien

„What is life?“ Mit den ersten vollständig entschlüsselten Genomsequenzen von Haemophilus influenzae und Saccharomyces cerevisiae eröffnete sich den Lebenswissenschaften Mitte der 1990er Jahre eine neue Ära – und eine Antwort auf Erwin Schrödingers Frage schien greifbar. Erstmals war es möglich, das Leben in seiner Gesamtheit und nicht nur in Teilen zu analysieren. Der anfänglich großen Euphorie folgte allerdings Ernüchterung, da die tatsächlichen Prozesse des Lebens nur bedingt von der genomischen Sequenz abgeleitet werden können. Die funktionelle Genomforschung versucht nun, hier anzuknüpfen.

Technologien zur Erfassung der Gesamtheit aller Proteine einer Zelle oder eines Organismus (Proteomik) kommen deshalb auf dem Weg vom Bauplan des Lebens zur Zellphysiologie eine besondere Bedeutung zu. Mit zunehmender Komplexität des betrachteten Organismus ist dieses Ziel schwerer zu erreichen. Deshalb bieten sich Bakterien mit ihren nur einigen hundert bis wenigen tausend verschiedenen Proteinspezies als Modellsysteme an. Das menschliche Proteom hingegen umfasst weit mehr als 100.000 Proteinspezies und scheint damit für eine systemweite Untersuchung noch zu komplex. Dies zu ändern und das humane Proteom in seiner Gesamtheit und Dynamik zu analysieren, ist Ziel intensiver Anstrengungen weltweit.

Um Einblicke in die molekularen Vorgänge des Lebens zu gewinnen, sind die Erfassung der molekularen Akteure des Lebens und damit die Inventur des Gesamtproteoms wichtige erste Schritte. Bereits Anfang der 1980er Jahre wurde deshalb begonnen, mit Hilfe der zweidimensionalen Gelelektrophorese Proteine des Gram-positiven Modellorganismus Bacillus subtilis zu analysieren. Diese Technik ermöglicht die Auftrennung hunderter verschiedener Proteinspezies. Wenig später ermöglichten Analysen mittels MALDI-ToF die Identifikation aufgetrennter Proteinspots. Als große Limitation dieser Technologie stellte sich aber schon bald das stark eingeschränkte analytische Fenster sowie die geringe Empfindlichkeit heraus. Vor allem hydrophobe Proteine oder Proteine mit extremen molekularen Massen oder isoelektrischen Punkten lassen sich damit nur aufwendig oder gar nicht nachweisen. Gelbasierte Methoden erlauben deshalb, nur einen kleinen Teil des Proteoms sichtbar zu machen. Diese Einschränkung konnte durch moderne gelfreie massenspektrometrische Verfahren überwunden werden. Sie ermöglichen die Analyse komplexer Proteingemische direkt nach Trypsinverdau und zeigen im Vergleich eine mehrfach höhere Auflösung. Trotz der genannten Nachteile finden gelbasierte Methoden vor allem für (bakterien-) physiologische Fragestellungen bis heute breite Anwendung. Mit ihrer Hilfe können beispielsweise unbekannte posttranslationale Modifikationen einfach sichtbar gemacht werden.

Die Bedeutung gelfreier Analysen ist für die Erfassung des Gesamtproteoms aber unumstritten. Optimierte Protokolle erlauben die umfassende Analyse des Proteoms Gram-positiver Bakterien in vier Hauptfraktionen: zytosolisches Proteom, Membranproteom, oberflächenassoziiertes Proteom und Sekretom. Untersuchungen des Sekretoms liefern beispielsweise wichtige Informationen über die Sekretionsleistung eines Organismus, was für die Optimierung von Enzymbildnern wie B. licheniformis im Rahmen der weißen Biotechnologie von großem (wirtschaftlichen) Interesse ist.

Erst Modellorganismus, dann Krankheitserreger

Die Kombination der beschriebenen Techniken erlaubt es, das Proteom von B. subtilis und anderen Bakterien nahezu vollständig zu erfassen. In jüngerer Zeit konnte die in Greifswald vorhandene Proteomexpertise vom Modellorganismus B. subtilis auf verwandte pathogene Bakterien, insbesondere Staphylococcus aureus, übertragen werden, um zu einem neuen Verständnis der Pathogenität dieser höchst gefährlichen Bakterien zu gelangen. Diese Bakterien können schwerwiegende und lebensbedrohliche Erkrankungen wie Sepsis, Endokariditis oder Osteomyelitis hervorrufen. Neben ihrem virulenten Potential zeichnen sich Staphylokokken durch die Fähigkeit aus, Resistenzen gegenüber allen bisher bekannten Klassen von Antibiotika zu erwerben. Solche multiresistenten Staphylokokken (MRSA) sind für etwa ein Drittel der gefürchteten und nur schwer zu behandelnden Krankenhausinfektionen verantwortlich. Die weltweite Ausbreitung von MRSA nährt die Befürchtung, in präantibiotische Zeiten zurückzufallen.

Der „Panoramablick“ der Proteomanalyse soll deshalb helfen, die Physiologie und Pathogenität dieses Bakteriums in einer neuen Komplexität und Dimension zu erfassen und zu verstehen. Auch hier galt der erste Schritt der möglichst vollständigen Charakterisierung des Gesamtproteoms. Unter Berücksichtigung verschiedenster Wachstumsbedingungen, Nährstoffmangel- und Stresssituationen konnten mehr als 80% aller exprimierten Proteine nachgewiesen werden (Abb. 1). Neue Methoden der absoluten Quantifizierung ermöglichen einen nahezu lückenlosen Überblick über aktive Stoffwechselprozesse und den Abgleich mit Konzentrationen von Stoffwechselintermediaten (Metabolomics).

Infektionen: Welche Proteine sind relevant?

Untersuchungen des oberflächenassoziierten Proteoms sowie des Sekretoms sind im Falle pathogener Bakterien von besonderem Interesse. Diese Proteine vermitteln den ersten Kontakt mit dem menschlichen Wirt und sind damit von zentraler Bedeutung für Kolonisierung, Invasion und Biofilmbildung. Das Sekretom umfasst die Mehrzahl der Virulenzfaktoren. Diese Studien leisten damit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Pathogenität von S. aureus, was wiederum Voraussetzung für die Entwicklung effektiver Therapien ist. Neue Einblicke in infektionsrelevante Vorgänge zu gewinnen und damit geeignete Ziele für neue Behandlungsstrategien zu identifizieren, zählt zu den wichtigsten aktuellen Herausforderungen der Forschung.

Nicht weniger bedeutend ist die Identifikation von Markerproteinen, deren Expression einen spezifischen physiologischen Zustand des Bakteriums signalisieren. So lassen sich die Bedingungen im natürlichen Habitat oder infiziertem Gewebe besser verstehen. Für S. aureus konnte basierend auf den Proteomstudien der letzten Jahre eine Proteomsignaturbibliothek aufgebaut werden. Sie vergleicht relative Proteinsyntheseraten unter verschiedenen infektionsrelevanten Bedingungen wie Sauerstoffmangel, oxidativem Stress oder nach Antibiotikaexposition. Diese In-vitro-Befunde müssen nun um Untersuchungen zur Interaktion von Pathogen und Wirt in vivo erweitert werden. In solchen Studien (Infektionssettings) ist der Nachweis von bakteriellen Proteinen vor dem Hintergrund massiver Mengen an Wirtsproteinen problematisch. Mittels Kombination von Fluoreszenzmarkierung der Bakterien, Zellsortierung und hochsensitiven massenspektrometrischen Verfahren konnte aber ein optimierter Arbeitsablauf etabliert werden, der es erlaubt, Proteine aus nur einer bis drei Millionen Bakterien, die nach Internalisierung durch humane Wirtszellen reisoliert wurden, effektiv zu erfassen (Abb. 2). Inzwischen erlauben weitere Verbesserungen dieses standardisierten Arbeitsablaufs, aus nur einer bis zwei Milllionen Bakterien über 50% aller kodierten S. aureus-Proteine nachzuweisen. Dies eröffnet neue Möglichkeiten, die Adaptation von S. aureus an das intrazelluläre Mileu der Wirtszelle zu untersuchen. Effiziente Visualisierungsmethoden unterstützen die infektionsbiologische Interpretation der gewonnenen Daten und deren Abgleich mit der Proteomsignaturbibliothek. Dies alles trägt zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie von S. aureus und anderen Krankheitserregern bei, um die Voraussetzungen für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien im Kampf gegen gefährliche Infektionskrankheiten zu schaffen.

Wie organisieren Proteine das Leben?

Mit der Erfassung des Proteininventars und seiner Dynamik in Modellorganismen wie B. subtilis und S. aureus ist der entscheidende zweite Schritt nach der Genomsequenzierung auf dem Weg zum Verständnis des Lebens gemacht. Die komplexen Regulationsmechanismen der Genexpression garantieren, dass jedes einzelne Protein in der aktuell benötigten Menge und zur rechten Zeit zur Verfügung gestellt werden kann. Der nächste Schritt wird es nun sein, zu verstehen, wie die Lücke von der Bereitstellung des Proteininventars bis zum eigentlichen zellulären Leben geschlossen werden kann. Systembiologische Arbeiten beschäftigen sich mit den Interaktionen der Proteine und legen damit ein immer größer werdendes, fragiles Proteinnetzwerk frei. Proteine werden modifiziert, geschädigt, repariert. Irreparable oder nicht mehr benötigte Proteine geben ihre wertvollen Ressourcen im proteolytischen Abbau wieder frei. So beschreibt das Leben der Proteine das Leben des Organismus. Der Weg von der Proteinsynthese am Ribosom bis zu den eigentlichen Prozessen des Lebens bleibt noch lange nicht verstanden und stellt die zell- und systembiologische Herausforderung der kommenden Jahre dar – letztlich um Schrödingers Frage „What is life“ neu zu beantworten.

Bei längeren Inkubationszeiten wird die Verdunstung in 96-Well-Platten zu einem kritischen Faktor. Insbesondere in Rand-Wells tritt Flüssigkeitsverlust durch Verdunstung auf, da diese Wells nicht vollständig von benachbarten Wells umgeben sind. Das Isolieren der Rand-Wells mit Flüssigkeit kann die Verdunstung reduzieren. Ohne Isolierung zeigen die äußeren Wells der Eppendorf 96-Well-Zellkulturplatte nach fünftägiger Inkubation unter Zellkultur-Standardbedingungen eine durchschnittliche Verdunstung von nur 1,8%. Der geringe Flüssigkeitsverlust ist wahrscheinlich auf die optimierte Passgenauigkeit von Deckel und Platte zurückzuführen. Das Befüllen des äußeren Grabens mit Flüssigkeit reduziert die Verdunstungsrate auf weniger als 1%. Wie in Abbildung 1 gezeigt, ermöglicht das „Chimney-Well“-Design der Eppendorf-Platte die zusätzliche Befüllung des Well-Zwischenraumes, was die Verdunstung in den Rand-Wells auf lediglich 0,3% sinken lässt. Jede Flüssigkeit, wie steriles PBS, Wasser oder Zellkulturmedium eignet sich zum Befüllen des Grabens und des Zwischenraumes. Durch die Konstruktion der Eppendorf-Zellkulturplatte lässt sich der komplette Zwischenraum mit nur einem Pipettierschritt befüllen.

Der Vergleich verschiedener 96-Well-Zellkulturplatten (s. Abb. 2 und Tabelle) zeigt, dass die Eppendorf-Zellkulturplatte die einzige Platte ist, welche die Verdunstung effektiv minimiert. Hersteller A bietet die Möglichkeit einer teilweisen Isolierung der äußeren Wells; allerdings konnte hier nach wie vor ein deutlicher Edge Effect beobachtet werden wenn auch abgeschwächter, im Vergleich zu den Herstellern B und C. Das Befüllen des gesamten Well-Zwischenraumes der Eppendorf-Zellkulturplatte trägt zu einer homogenen Feuchtigkeitsverteilung und Temperaturstabilität innerhalb der Platte bei. Dies führt zu einer verminderten Verdunstungs- und Kondensationsrate, was den Edge Effect drastisch reduziert.

Literatur:

1]  Walzl A, Kramer N, Mazza G, Rosner M, Falkenhagen D, Hengstschläger M,     Schwanzer-Pfeiffer D, Dolznig H. Int J Appl Sci Technol. 2012 June; 2(6):
[2]  Patel MI, Tuckerman R, Dong Q Biotechnology Letters 2005; 27: 805–808
[3]  Lundholt BK, Scudder KM, Pagliaro L Journal of Biomolecular Screening 2003; 8: 566

Kontaktadresse:

Jessica Wagener
FieldApplication Specialist - Cell Handling Eppendorf AG
Barkhausenweg 1
22339 Hamburg

wagener.j[at]eppendorf.de

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