Thema: Proteomik

Blitzlicht

Analyse von Protein-„small molecule“-Interaktionen

Untersuchungen zu Protein-Wechselwirkungen sind sowohl für das Verständnis biologischer Prozesse als auch für die Medikamentenentwicklung elementar. Insbesondere für die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen sind robuste und screeningfähige Methoden unverzichtbar. Die neue NanoBRETTM-Technologie erlaubt den Aufbau von robusten Protein-Interaktionssystemen in lebenden Zellen mit einem vorteilhaften Signal-Hintergrund-Verhältnis. Die Anwendung von NanoBRETTM umfasst sowohl die Analyse von Protein:Protein- als auch Protein:„small molecule“ Interaktionen (Target Engagement).

Die NanoBRETTM-Technologie ermöglicht mittels Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) den Aufbau von robusten und screeningfähigen Testsystemen für zahlreiche Fragestellungen mit biologischer und medizinischer Relevanz. Der Wert dieser neuen Plattform zeigt sich bereits an aktuellen Untersuchungen für epigenetische Targets.

Grundlage der NanoBRETTM-Technologie

Herzstück der Technologie stellt die kleine und lichtintensive NanoLuc-Luciferase dar, die mittels BRET einen fluoreszenten Liganden zum „Leuchten“ bringt. Die NanoLuc®-Luciferase dient dabei als Donor-, der fluoreszente Ligand (NanoBRETTM 618) als Akzeptormolekül. Donor- und Akzeptor-Emissionen überlappen nur geringfügig, wodurch hervorragende Signal-Hintergrund-Verhältnisse erreicht werden, die eine sensitive Messung in einem breiten dynamischen Messbereich ermöglichen. Dies stellt letztlich den entscheidenden Vorteil gegenüber konventionellen BRET-Systemen dar, die auf Basis der vergleichsweise signalschwachen Renilla-Luciferase beruhen.

NanoBRETTM für die Analyse von Protein:Protein-Interaktionen (PPI)

Zur Untersuchung von Protein:Protein-Wechselwirkungen wird einer der Interaktionspartner als NanoLuc®-Fusionsprotein, der andere Partner als HaloTag®-Fusionsprotein exprimiert. Der Energietransfer auf den fluoreszenten NanoBRETTM-618-Liganden findet nur dann statt, wenn beide Interaktionspartner sich in einem Abstand zueinander von weniger als 10 nm befinden. Der fluoreszente Ligand ist dabei kovalent an das HaloTag®-Protein gebunden (siehe Abbildung). Für einige Anwendungsgebiete – wie beispielsweise die Epigenetik – gibt es bereits gebrauchsfertige NanoBRETTM-Assays. Hierbei handelt es sich um vorgetestete und optimierte Proteinpaare, welche für Induktions- und Inhibierungsstudien eingesetzt werden. Erhältlich sind unter anderem therapeutisch interessante Bromodomain-Histon-Proteinpaare.

Interaktionen mit niedermolekularen Molekülen

Die Analyse von Interaktionen zwischen Proteinen und niedermolekularen Molekülen („small molecules“) in lebenden Zellen ist ein weiteres Anwendungsgebiet der NanoBRETTM-Technologie. Hierbei wird der fluoreszente NanoBRETTM-Ligand chemisch an eine niedermolekulare Verbindung gekoppelt und das entsprechende Zielprotein als NanoLuc-Fusionsprotein exprimiert.
Dadurch lassen sich Systeme aufbauen, um direkt Interaktionen zwischen einem Protein-Target und der entsprechenden Substanz in lebenden Zellen zu messen (Target Engagement). Diese Systeme können sowohl für Inhibierungsstudien als auch für Induktionsstudien eingesetzt werden.

Fazit:
Zusammengefasst handelt es sich bei NanoBRETTM um eine robuste Technologie für die Analyse von Proteininteraktionen in lebenden Zellen. Dank der vielfältigen Kombinationsmöglichkeiten der Technologie sind umfassende Untersuchungen sowohl von Protein:Protein als auch Protein:„small-molecule“-Interaktionen möglich.


Kontakt:
Promega GmbH
Dr. Caroline End
Produktmanager Proteomics
Tel.: +49 (0)621 850 11 87
caroline.end[at]promega.com
www.promega.com

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