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Blitzlicht

Multiplex-Analysen mit Targeted Proteomics

Nature Methods kürte Ende vergangenen Jahres das bioanalytische Verfahren der gezielten Proteomanalyse – Targeted Proteomics – zur Methode des Jahres 20121. Die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen mit massenspektrometrischen Geräten und Verfahren der neuesten Generation weist ein grosses Potential für die pharmazeutische Forschung und klinische Diagnostik auf.

Die Mehrzahl der klinisch relevanten Biomarker sind Proteine. Der Bedarf für multiplexe Proteinanalysen – damit ist die gleichzeitige Messung einer Vielzahl an Proteinen gemeint – wächst mit der zunehmend personalisierten Medizin. Mit der Proteinanalyse sollen einerseits die vollständigen Proteinprofile der Patienten (Diagnose) detektiert, andererseits geringste Veränderungen durch biomolekulare Wirkstoffe im Körper (Behandlungen) bei einem hohen Probendurchsatz erfasst werden. Die weit verbreiteten Antikörper-basierten Methoden können jedoch nur eine limitierte Anzahl von Proteinen gleichzeitig analysieren und benötigen lange Entwicklungszeiten bei zugleich hohen Investitionen. Das Massenspektrometrieverfahren Targeted Proteomics, schliesst diese Lücke, indem es die kosteneffiziente, simultane Messung von mehr als tausend Proteinen erlaubt.

Entwicklung und Stand 

Historisch gesehen hat sich die Proteomanalyse langsamer entwickelt als die Genomics – hauptsächlich, weil Proteine komplexere biologische Moleküle sind als DNA. Sie bestehen aus 20 chemisch sehr unterschiedlichen Aminosäuren, verglichen mit den nur vier Nukleinsäurebausteinen der DNA. Die neuesten Analysenverfahren der Targeted Proteomics sind jedoch spezifisch genug, um jede einzelne Aminosäure zu unterscheiden. Dies ermöglicht ein Messverfahren, das für alle Proteine gleichzeitig anwendbar ist und nicht Protein für Protein neu entwickelt werden muss. 

Die zentralen Ansätze im Bereich Targeted Proteomics basieren alle auf einer Kombination von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Massenspektrometrie (MS). Das ältere Shotgun-Massenspektrometrie-Verfahren basiert zwar auch auf dieser Kombination, es wird jedoch hauptsächlich zur explorativen Analyse verwendet, wenn die Zielproteine noch nicht bekannt sind (siehe Abb. 1). Der Shotgun-Ansatz ist eher qualitativ und nicht gut zur präzisen Quantifizierung geeignet. 

Multiple Reaction Monitoring, kurz MRM oder SRM genannt, ist das erste Targeted Proteomics-Verfahren, mit dem sehr spezifisch bis zu 100 Proteine mit hoher Quantifizierungsgenauigkeit gleichzeitig in einer Probe gemessen werden können. MRM ermöglicht es, den Fokus auf einen zuvor festgelegten Satz an Zielproteinen zu legen und ist damit ideal für Verifikations- und Validierungsstudien geeignet. MRM-Messungen von Proteinen werden auf Triple-Quadrupol-Massenspektometern durchgeführt, die in analytischen Laboren weit verbreitet sind. Die Verwendung von qualitativ guten MRM-Assays, also Proteinsignaturen mit zugehörigen Einstellungen für das Massenspektrometer, ist eine wichtige Voraussetzung für eine zuverlässige Messung. Heute gibt es bereits standardisierte MRM-Assays für viele Proteine und verschiedene Probenarten auf dem Markt, die eine kosten- und zeitintensive Entwicklung überflüssig machen.

Das auf SWATH™ Acquisition basierte Analyseverfahren Hyper Reaction Monitoring ist die neueste Weiterentwicklung der Targeted Proteomics. Es vereint die Vorteile von Shotgun und MRM.

Hyper Reaction Monitoring – HRM-MS™

Der Ansatz ermöglicht die vollständige Messung aller detektierbaren Proteine einer Probe, also die Identifizierung und Quantifizierung von Tausenden von Proteinen in nur einer Messung. HRM-MS™ bietet somit nicht nur das höchste Multiplexing, sondern auch eine mit MRM vergleichbare quantitative Genauigkeit (siehe Abb. 2). 

Ein entscheidender Vorteil von HRM-MS™ ist die Möglichkeit der retrospektiven Analyse der Proteine in der Probe, ohne die Messung wiederholen zu müssen. Da bei einer HRM-MS™-Messung die Signale von allen detektierbaren Proteinen erfasst werden, muss die Proteinliste zum Zeitpunkt der Messung nicht fix definiert sein, und die Quantifizierung von neuen Proteinen kann zu einem späteren Zeitpunkt mit marginalen Kosten in silico durchgeführt werden. Gerade für präklinische Studien stellt dies eine ausgezeichnete Methode dar, da selbst ohne die Lagerung von physischen Proben keinerlei Informationen für spätere Analysen verlorengehen. Das digitale Abbild beziehungsweise die Speicherung der Messdaten genügen für die Analyse von neuen Zielproteinen.

Aktuelle Herausforderungen der Targeted Proteomics sind die Interlaborreproduzierbarkeit, das heißt die Übertragbarkeit und Standardisierung von Messmethoden zwischen Laboren, sowie die Datenflut der HRM-MS™- oder SWATH™ Acquisition-Analyse. Im Folgenden werden vielversprechende Lösungen aus dem Feld präsentiert, welche diese beiden Aspekte abdecken.

Innovative Lösungen für aktuelle Herausforderungen 

Der zentrale Faktor für die Kalibrierung der Targeted Proteomics-Analyse sowie für die damit verbundene Messgenauigkeit ist die präzise Vorhersage der Retention Time (RT) der Peptide. So wird die Elutionszeit des Peak-Maximums im Flüssigkeitschromatographen genannt. Die Verwendung der Indexed Retention Time (iRT) verbessert genau diese Vorhersage, was neben einer höheren Messgenauig­keit auch ein deutlich größeres Multiplexing erlaubt2. Die iRT-Skala ist definiert durch einen Standard-Satz an iRT-Referenzpeptiden. Der iRT-Wert für jedes weitere Peptid kann einmal empirisch bestimmt werden und ist danach für MRM, HRM-MS™ und die SWATH™ Acquisition-Analyse geeignet. iRT ist unabhängig vom jeweiligen chromatographischen Setup und erlaubt durch die Standardisierung der RT-Werte erstmals einen Transfer von Targeted Proteomics-Messmethoden zwischen Geräten und Labors mit unterschiedlichen Einstellungen.

Betrachtet man existierende Software zur Analyse der Messdaten, so ist Skyline die populärste Open-source-Targeted Proteomics Software3. Entwickelt vom McCoss-Labor an der Universität Washington, wurde die Software bis heute bereits 13.000-mal installiert. Das innovative iRT-Konzept wurde im Februar 2012 in Skyline integriert. Im Januar 2013 erschien die neueste Software auf dem Markt – Spectronaut™ von Biognosys, speziell entwickelt für Daten der HRM-MS™ und SWATH™ Acquisition-Analyse4. Angesichts der durch die neuen Messverfahren gewachsenen Datenflut bietet diese Software eine bis zu 100-fache Steigerung der Analysegeschwindigkeit. Durch die vollständig automatisierte Kalibrierung der Messparameter werden die bestmögliche Selektion von Proteinsignalen und die daraus folgende Quantifizierung erreicht (Abb. 3).

Blick in die Zukunft 

Die Auszeichnung von Targeted Proteomics als Methode des Jahres 2012 verdeutlicht, dass die Methode nicht nur für die Grundlagenforschung relevant ist, sondern auch ein grosses Potential für die pharmazeutische Forschung und klinische Diagnostik aufweist. Denn Targeted Proteomics beschleunigt die Entdeckung von Biomarkern sowie deren klinische Validierung, wobei die Verfügbarkeit von standardisierten MRM-Assay-Panels wesentlich dazu beiträgt. Validierte Biomarker ermöglichen die Bestimmung von Patientengruppen sowie eine gezieltere und damit effektivere Behandlung. Zudem werden mit der Erhöhung des Probendurchsatzes digitales Biobanking – also die umfangreiche Speicherung von Messdaten – sowie erste Ansätze in der routinemässigen Diagnostik immer greifbarer. Aus diesen Gründen ebnen die Targeted Proteomics-Verfahren der neuesten Generation den Weg in die Zukunft der Bio- und Pharmaanalytik.

Literatur

[1] Nature Publishing Group. Method of the Year 2012. Editorial, Nature Methods 10(1): 1 (2013).
[2] Escher, C. et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides, Proteomics 12(8): 1111-1121 (2012). 
[3] MacLean, B. et al. Skyline: An open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics 26(7): 966-998 (2010).
[4] Bernhardt, O. et al. Spectronaut – A fast and efficient algorithm for MRM-like processing of data independent acquisition (SWATH-MS) data. ASMS (2012).

Die Biognosys AG ist ein Pionier im Feld der Targeted Proteomics, gegründet 2008 als ETH Zürich Biotech Spin-off aus dem Labor von Prof. Ruedi Aebersold.

 

Korrespondenzadresse

Dr. Yulia Butscheid
Biognosys AG
Wagistrasse 25
CH-8952 Schlieren, Schweiz
Tel.: +41-(0)44-738-2041
butscheid[at]biognosys.ch
www.biognosys.ch

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