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Blitzlicht

Vielfarben-dSTORM mit Carbocyanin-Farbstoffen

Wir haben eine neue Variante der direkten stochastischen optischen Rekonstruktions-Mikroskopie (dSTORM) mit dem Namen SD-dSTORM entwickelt1. SD steht für spektrale Entmischung (engl. spectral demixing). SD-dSTORM kombiniert die photochemischen Vorteile rot strahlender Carbocyanin-Farbstoffe mit dem Prinzip der spektralen Entmischung. Dabei geht es um die neue Kombination der beiden für hohe Auflösungen geeigneten Carbo­cyanin-Farbstoffe Alexa Fluor 647 und Alexa Fluor 700, die einwandfreie, Puffer-kompatible Blink-Charakteristika zeigen. Diese Eigenschaft wird insbesondere bei der Lokalisierung von Einzelmolekülen benötigt. Für eine wirklichkeitsgetreue, hochauflösende Rekonstruktion linearer und punktförmiger biologischer Nanostrukturen benötigt SD-dSTORM im Vergleich zu anderen hochauflösenden Mikroskopie-Technologien eine deutlich reduzierte Laser-Leistung und auch weniger Einzelaufnahmen.

Unter den momentan für die Einzelmolekül-Lokalisierung verfügbaren organischen Photo-schaltern sind die Carbocyanin-Farbstoffe Cy5 und Alexa 647 die effizientesten, da sie sehr photostabil sind (bis zu 6.000 Photonen je AN-Zyklus) und vor allem die Fähigkeit besitzen, in einer reduzierenden Umgebung sehr lang im AUS-Zustand zu verharren. Daher konzentrierten wir uns auf Alexa 647 und suchten einen Partnerfarbstoff, der sowohl den gleichen Puffer benötigt als auch jenen verlängerten AUS-Zustand aufweist. Schließlich wurde Alexa 700 ausgewählt. In einer 100 bis 300 millimolaren b-Mercaptoethylamin (MEA)-Lösung und bei Vorhandensein eines Fängers von Sauerstoffradikalen besitzt dieser Farbstoff bei einer Anregungswellenlänge von 643 nm den gewünschten verlängerten AUS-Zustand.

Ein Zweikanal-Emissionsteiler (Optosplit II, Cairn Research) wurde verwendet, um die sich überlappenden Emissionsspektren von Alexa 647 und 700 voneinander abzugrenzen. Die Emissionswellenlängen wurden mit Hilfe eines dichroitischen Spiegels (710 DCXR) und zwei Emissionsfiltern (HC 687/40 und ET 794/160) in Kurz- und Langwellenemission aufgespalten, wobei sie nebeneinander auf der EMCCD-Kamera (iXon 897, Andor) registriert wurden. Der dichroitische Spiegel und die Bandpassfilter wurden sowohl an die Einzellaser-linie (643 nm) als auch an die Emissionsspektren angepasst, mit dem Ziel die für die spektrale Entmischung benötigte Signalüberlappung zu optimieren.

Um die Qualität der Trennung der Spektren von Alexa 647 und 700 einschätzen zu können, wurden die Mikrotubuli von BS-C-1-Zellen mit im Handel erhältlichen Zweitantikörpern getrennt für jeden Farbbereich eingefärbt. Dabei wurden die Proben in dSTORM-Puffer (MEA, Sauerstoffradikalfänger) aufgenommen. Vor der eigentlichen Aufnahme der Bilder wurden die Fluorophore zunächst in den AUS-Zustand versetzt. Dazu wurde die Probe mit 3 bis 5 kW/cm2 starkem Laserlicht (Wellenlänge 643 nm) so lange beleuchtet, bis die Mikrotubuli-Struktur nicht mehr erkennbar war, dafür aber das zufällige Blinken der Farbstoffe einsetzte. Typischerweise wurden für eine Anregungswellenlänge 5.000 bis 20.000 Einzelbilder aufgenommen. Die EMCCD-Kamera lief dabei durchgehend.

Nach der Akquise der Bilder wurden die Orte, an denen sich die Einzelmoleküle befanden und deren jeweilige, individuelle Intensität, über die gesamte Zweikanalansicht mit der Open Source-Software rapidSTORM bestimmt. Dabei verwendeten wir einen von uns selbst geschriebenen Algorithmus, um ein möglichst vollständiges, zweifarbiges SD-dSTORM-Bild der Probe herzustellen. In Abbildung 1 ist die Streuung der Einzelmolekül-Aufenthaltsorte dargestellt, was erst dank der experimentellen optischen Auflösung des zweifarbigen SD-dSTORM-Systems möglich wurde. Die Analyse zeigt, dass die Aufenthaltsorte als vollständig eigenständige Punkte erscheinen – ein Beweis für die saubere Trennung der Farbkanäle. 

Ergebnisse

Die Auflösungen für beide Kanäle bewegen sich mit 22 nm für Alexa 647 und 30 nm für Alexa 700 in einem Bereich, der bereits zuvor für Alexa 647 bei der Lokalisierungsmikroskopie erreicht wurde. Die Anwendbarkeit von SD-dSTORM in der Zellbiologie wurde durch das Abbilden von Objekten des subzellulären Bereichs verdeutlicht. Für jene Objekte ist bekannt, dass sie je nach verwendetem Zweitantikörper unterschiedlich ausgeprägte Formen und räumliche Verteilungsmuster zeigen. Ausgewählt wurden sogenannte fokale Adhäsionen (engl. örtliche Anhaftungen, focal adhesions) – große Proteinkomplexe in der Peripherie der Zelle – und Clathrin-überzogene Membrangrübchen (clathrin-coated pits), 150 nm große, vesikuläre Objekte in der Nähe der Plasmamembran.

Beide befinden sich an jeweils verschiedenen Orten in der Zelle und überlagern darüber hinaus auch nicht das Mikrotubuli-Netzwerk. Daher sollten beide Strukturen als distinkte subzelluläre Objekte erscheinen. Die Zweifarben-SD-dSTORM stellt Mikrotubuli und fokale Adhäsionen (Abb 2A) beziehungsweise Mikrotubuli und Clathrin-überzogene Membrangrübchen (Abb. 2C) gut getrennt und hochaufgelöst dar. Der Kontrollversuch (Abb. 2B) zeigt Mikrotubuli, die sowohl mit Alexa 647 als auch mit Alexa 700 angefärbt wurden. Hier zeigt sich deutlich eine Übereinstimmung zwischen beiden Kanälen und aufgrund der hohen Auflösung auch die heterogene Verteilung der Proben auf derselben Struktur, die mit normaler Mikroskopie nicht sichtbar wäre.

Ausblick

Unser Ansatz ist ein bedeutender Fortschritt hin zu einer benutzerfreundlichen vielfarbigen Einzelmolekül-Mikroskopie. Er kombiniert die Vorteile der rot strahlenden Carbocyanin-Farbstoffe mit dem Prinzip der spektralen Entmischung, um dSTORM effizient, verlässlich und schnell durchführen zu können. SD-dSTORM bietet die Möglichkeit, auch auf mehr als zwei Farben ausgeweitet zu werden. Dabei kommen andere, verwandte rote Farbstoffe wie Alexa 750 in Frage. Außerdem kann die Technologie mit jeder kommerziell erhältlichen Lokalisierungs-Software wie QuickPALM and rapidSTORM kombiniert werden. Auch für die Echtzeitverfolgung mit Hilfe von tag-Technologien wird SD-dSTORM in Zukunft häufiger mit Erfolg eingesetzt werden.

Literatur

[1] Multi-color direct STORM with red emitting carbocyanines, Biology of the Cell (2012), DOI: 10.1111/ boc.201100011. 

 

Korrespondenzadresse

Dr. Jan Schmoranzer
Group Leader in Super-Resolution Microscopy and Cell Polarity
Freie Universität Berlin
Institut für Chemie und Biochemie
Takustraße 6
14195 Berlin
Tel.: +49-(0)30-838-56-822
Fax: +49-(0)30-838-56-908
janschmoranzer[at]fu-berlin.de
www.sfb958.de

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