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Blitzlicht

Minimalinvasive Methoden in der Elektronentomografie

Ein Bild sagt mehr als tausend Worte – das gilt auch in den Naturwissenschaften. Seit jeher sind dabei mikroskopische Techniken ein wesentliches Hilfsmittel zur Bildgewinnung. Das Ziel ist es, ein möglichst detailgetreues Bild vom lebenden Organismus zu erstellen, um Strukturen und deren Funktionen zu untersuchen. Bis heute bleibt der Traum, die Einzelheiten bis hin zu den molekularen Bausteinen herauszuvergrößern. Hierbei kommt der Elektronenmikroskopie eine besondere Bedeutung zu, da mit ihr – im Vergleich zu Lichtmikroskopen – Objekte abgebildet werden können, die mehrere hundert mal kleiner sind. Mit Hilfe der hier von uns vorgestellten Präparationsmethode, den fokussierten Ionenstrahlen (FIB, engl.: focused ion beam) kann man so dünne Proben erzeugen, dass nun auch elektronenmikroskopische Blicke ins Innere einer Zelle möglich sind. So können erstmals die Vorgänge innerhalb der Zelle mit hoher Auflösung dreidimensional dargestellt und analysiert werden.

Die Bildgebung mit Elektronen kann entweder mit Hilfe der Raster-Elektronenmikroskopie, (kurz REM oder SEM) oder der Transmissionselektronenmikroskopie (kurz TEM) erfolgen. Die Kehrseite der Medaille dieser hochauflösenden Methoden: Lebende Organismen und Zellen können nicht direkt im Hochvakuum bei einem konstanten „Bombardement“ mit Elektronen untersucht werden. Spezielle Präparationsmethoden sind deshalb notwendig, um die delikaten und vor allem strahlenempfindlichen Strukturen in ihrer wässrigen Umgebung zu erhalten und im Besonderen für die TEM zugänglich zu machen. Um die nötige „Transparenz“ für Elektronen zu erreichen, müssen Dünnschnitte angefertigt werden, da Elektronen nur eine sehr kurze Distanz in Materie zurücklegen können. Die Ultramikrotomie ist dabei die Präparationsmethode der Wahl, um mechanisch Schnitte mit Dicken von ca. 50-500 Nanometern anzufertigen. Jedoch können diese „invasiven“ Prozeduren zu massiven Veränderungen der Struktur der zu untersuchenden Objekte führen und somit die erreichbare Auflösung im TEM einschränken.

Um biologische Objekte, wie beispielsweise Makromoleküle und Molekülkomplexe, innerhalb der Zelle in ihrer natürlichen wässrigen Umgebung sichtbar zu machen und zu charakterisieren, müssen Verfahren angewendet werden, die jegliche Strukturveränderungen ausschließen. Kryo-Präparationsverfahren ermöglichen es heute, den hohen Wasseranteil (> 70 %) von Zellen und Geweben aufrechtzuerhalten. Dies gelingt durch schockartiges Einfrieren der Proben innerhalb von Millisekunden auf -190°C. Die Wassermoleküle kristallisieren so nicht, und es bildet sich ein glasartiges (amorphes) Eis. Dieser Vorgang der Vitrifizierung erlaubt es, wenige Mikrometer dicke biologische Präparate einzufrieren. Für größere Objekte sind Hochdruckverfahren (high-pressure freezing) notwendig, die die Einfriertiefe nahezu verzehnfachen. Letzteres Verfahren erfordert die Anfertigung von Dünnschnitten unter Kryo-Bedingungen (d.h. < -140°C), um den vitrifizierten Zustand der Probe zu erhalten. Beim mechanischen Schneiden hochdruckgefrorener Proben treten ebenfalls irreversible Veränderungen auf, die eine Interpretation der anschließenden Strukturen in den mikroskopischen Aufnahmen erschwert.

Für die Mikroskopie mit vitrifizierten biologischen Präparaten bei Temperaturen unterhalb von -140°C wird üblicherweise der Präfix Kryo vorangestellt, wie beispielsweise bei der Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie, kurz Kryo-EM. Neben der bestmöglichen Bewahrung biologischer Strukturen durch Vitrifizierung lassen sich zudem Strahlenschäden bei tieferen Temperaturen verringern.

3D-Bild aus Elektronentomogrammen

In der Elektronenmikroskopie an biologischen Proben spielt die Kryo-Elektronentomographie (kurz Kryo-ET) eine herausragende Rolle – denn selbst relativ dünne, durchstrahlbare Präparate haben eine räumliche Dimension, das heißt, die resultierenden TEM-Bilder sind nur zweidimensionale (2D-) Repräsentationen (Projektionen) einer dreidimensionalen Probe. Einzelheiten aus unterschiedlichen Ebenen innerhalb eines Objekts werden in einem Bild überlagert und lassen sich so in einer einzelnen 2D-Aufnahme nicht trennen. Ähnlich wie in der medizinischen Diagnostik werden tomographische Verfahren auf schockgefrorene Präparate angewendet, um dieses Durcheinander, welches durch die Überlagerung struktureller Einzelheiten ensteht, zu beseitigen. Bei der ET wird die Probe in kleinen Winkelschritten durch den senkrecht dazu einfallenden Elektronenstrahl gedreht und für jeden Kippwinkel ein 2D-Bild aufgezeichnet. Durch anschließende Rekon-struktion dieser Serie von Projektionen lässt sich ein 3D-Bild des untersuchten Objekts erhalten. Nicht-„invasive“ Untersuchungen lassen sich mit Hilfe der Kryo-ET an kleineren – und vor allem dünneren – Objekten wie prokaryotischen Zellen und isolierten Organellen direkt durchführen. Auch flache Randbereiche eukaryotischer Zellen sind direkt zugänglich, wenn diese eine Dicke von ca. 500 nm nicht überschreiten. Um dickere Präparate, vor allem ganze eukaryotische Zellen, Zellverbände oder gar Gewebe untersuchen zu können bedarf es geeigneter minimal-invasiver Präparationsverfahren, die zudem mögliche Strukturveränderungen und Artefakte vermeiden.

Dünne Proben dank Ionenstrahlen

Eine alternative Methode zum mechanischen Schneiden von größeren Objekten bietet das Ionenstrahl-Mikroskop (kurz FIB: Focused Ion Beam). Hauptsächlich wird dieses Instrument in der Halbleiterherstellung zur Oberflächenanalyse und -bearbeitung eingesetzt. Es vereint die Vorteile eines REM und eines Ionenmikroskops. Letzteres kann nicht nur zur Bildgebung, sondern auch für eine gezielte Materialbearbeitung im Nanometerbereich verwendet werden. Schwere, große Ionen wie Gallium besitzen eine höhere Wechselwirkung und schießen förmlich einzelne Probenatome heraus. So „fräsen“ sie sich (kontrolliert und schonend) Schicht für Schicht in das Probenmaterial, bis letzlich eine elektronentransparente Lamelle übrigbleibt. Neben der Vermeidung jeglicher mechanischer Interaktion, Schneidartefakten und den damit verbundenen Struktur-Veränderungen ergibt sich ein weiterer Vorteil dieser Methode: Zu jedem Zeitpunkt lässt sich dieser „Fräs“-Prozess mit dem REM beobachten und damit gegebenenfalls korrigieren. Um empfindliche, eiseingebettete biologische Proben für dieses Verfahren zugänglich zu machen waren Neu- und Weiterentwicklungen methodischer und instrumenteller Art notwendig. Vor allem die restriktiven Temperaturbedingungen – die Probe darf nicht wärmer als -140°C werden – und die immanente Strahlenempfindlichkeit des biologischen Probenmaterials erforderten neue Konzepte. 

Ein spezieller Kühlkörper und ein eigens dafür gebauter dreh- und kippbarer Probenhalter/Tisch bildeten die Grundlage, um die ersten Fenster in das Innere von Zellen zu öffnen. Der Kühlkörper selbst ist das Produkt einer weiteren neuartigen dreidimensionalen Fertigungstechnik, dem schnellen Modellbau, dem sogenannten 3D rapid-prototyping (ein laserbasiertes dreidimensionales Druckverfahren). Mit herkömmlichen feinmechanischen Produktionsverfahren wäre dieser Kühlkörper nicht realisierbar gewesen.

Da das Ionen-„fräsen“ oder -dünnen direkt auf einem TEM-Probenhalter (mit einer hauchdünnen löchrigen Kohlefolie belegtes Metall-Netzchen, welches auch EM-Grid genannt wird) stattfindet, ist es notwendig, den Ionenstrahl unter sehr flachen Einfallwinkeln auf das Präparat auftreffen zu lassen – ohne entsprechende Kippung und Drehung des Probentisches eine nicht zu lösende Aufgabe. Zudem gewährleistet der ‚streifende Einfall’ des Ionenstrahls eine minimale Strahlenbelastung für die entstehende Lamelle im Inneren der eiseingebetteten Zelle (Abb. 1). Sind die richtigen Voraussetzungen geschaffen, ist das eigentliche Ionenstrahldünnen fast ein Kinderspiel. Jedoch müssen die Präparationsparameter, wie etwa die Verweilzeit des Ionenstrahls, Stärke des Ionenstroms und die Geschwindigkeit der Ionen, je nach Dicke und Beschaffenheit des Probenmaterials experimentell bestimmt und angepasst werden. Die Herstellung einer Lamelle dauert weniger als eine Stunde. Typischerweise werden bis zu 5-10 Probenbereiche pro EM-Grid so erschlossen. Die fertigen Präparate können anschließend ins Kryo-EM transportiert und mit Hilfe der ET untersucht werden. Dieser ‚Transport‘ ist ein weiterer kritischer Schritt, weil er unter Kryo-Bedingungen erfolgen muss.

Fazit

Mit Hilfe dieser neuen Methode ist es nun möglich, gezielt und vor allem reproduzierbar Fenster ins Innere von Zellen zu öffnen. In Kombination mit der Kryo-Elektronentomographie lassen sich nun Vorgänge innerhalb der Zelle mit hoher Auflösung dreidimensional darstellen und analysieren (Abb. 2). Diese detaillierten Einblicke in bisher unzugängliche molekularen Landschaften im Zellinneren eröffnen neue Ansätze für die Forschung und erweitern unser Verständnis der fundamentalen Prozesse des Lebens.

Korrespondenzadresse

Dr. Jürgen M. Plitzko, Projektleiter TEM
Abteilung Molekulare Strukturbiologie
Max-PIanck-Institut für Biochemie 
Am Klopferspitz 18, D-82152 Martinsried
plitzko[at]biochem.mpg.de

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Heft 3/2012

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