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Scharfer Blick ins Gehirn lebender Mäuse

Zum ersten Mal kann man Prozesse am lebenden Gehirn mit einer Auflösung von weniger als 70 Nanometern beobachten. Dabei war der Sprung von den Hirnschnitten zum Cortex laut Stefan Hell technisch gesehen gar nicht einmal so dramatisch. Der Wert der hier vorgestellten Publikation sei viel mehr, dass eine psychologische Barriere durchbrochen worden ist. LABORWELT sprach mit Hell aber auch über die Grenzen der STED (engl. stimulated emission depletion)-Mikroskopie.

Nanoscopy in a Living Mouse Brain, Science 2012, Vol. 335 no. 6068 p. 551

LABORWELT:

Was zeichnet die STED-Mikroskopie aus?

Hell: 

Mit dem STED-Mikroskop kommt man über die Beugungsgrenze des Lichts hinaus und kann so detaillierterer mikroskopieren. Über mehr als 1.000 Jahre war die Auflösungsgrenze bei einem Lichtmikroskop und dadurch inhärent auch bei einem Fluoreszenzmikroskop fundamental begrenzt auf etwa 200 nm. Zwar gab es viele Ideen, diese Grenze zu durchbrechen, aber bei einem fokussierenden Mikroskop ist man in der Praxis letztendlich nicht über 200 bis 150 nm hinausgekommen. Die STED-Mikroskopie war das erste Verfahren, das – in Konzept und Praxis – gezeigt hat, dass man deutlich über die Beugungsgrenze hinauskommt und Auflösungen auf Molekülgröße erreicht.

Sie hat im Gegensatz zu anderen Konzepten das Fluoreszenzmolekül ins Zentrum der Aufmerksamkeit gerückt. Anfang der 90er Jahre herrschte die Vorstellung, dass man die Beugungsgrenze erhöhen könne, wenn man das Licht selbst in seiner Ausbreitung einschränkt, indem man es durch eine winzige Spitze einer gezogenen Faser zwängt. Diese Nahfeldmikroskope funktionieren in den Materialwissenschaften an Probenoberflächen ziemlich gut. Innerhalb eines transparenten Materials wie der Zelle ist sie hingegen kaum realisierbar – schon gar nicht in einer lebenden Zelle oder in 3D.

Bei der STED-Mikroskopie bleiben die Lichtwellen, was sie sind. Die Unterscheidung eng benachbarter Strukturen erfolgt über die Fluorophore. Im Falle zweier Mikrotubuli sorgt man beispielsweise dafür, dass die eine Struktur nicht leuchtet, wenn die andere leuchtet – und umgekehrt. So können die beiden Strukturen voneinander unterschieden werden.

LABORWELT:

Was war Stand der Technik vor der Entwicklung der in vivo-STED-Mikroskopie?

Hell:

Auch am lebenden Gehirn betrug die höchste erreichte Auflösung 300 nm. Dieser Wert wurde mit der 2-Photonen-Mikroskopie erreicht.

LABORWELT:

Wie schwierig war der Schritt vom Gehirnschnitt zur lebenden Maus?

Hell:

Das wohl Schwierigste war, den Mut zu haben, das zu machen. Technisch gesehen ist der Schritt gar nicht so groß. Die Maus muss gut anästhetisiert sein. Wir haben Herzschlag, Atmung und Blutfluss kontrolliert und ganz allgemein für ein stabiles System gesorgt. Alles in allem wurden dafür ganze vier Wochen investiert. Allerdings war die Methode bei uns schon an lebenden Gehirnschnitten etabliert. Bei Kollegen ohne das entsprechende Vorwissen war hingegen eine gewisse Skepsis verbreitet. 

LABORWELT:

Was haben Sie im Maus-Cortex beobachtet?

Hell:

Es finden kleine morphologische Veränderungen im Gehirn der erwachsenen Maus statt. Die kleinen Fortsätze der Dendriten, die sogenannten Dornen, bewegen sich. Um auszuschließen, dass diese Bewegung nicht aufgrund eines sich ändernden Fokus zustande kommt, haben wir die Bilder in verschiedenen Ebenen aufgenommen und miteinander abgeglichen. Über die Art der Bewegung, die Frequenz und den Grund wissen wir allerdings noch gar nichts.

LABORWELT:

Wie könnte man die Technik noch verbessern?

Hell:

Der Einfachheit halber haben wir uns zunächst für ein sich frei im Zellplasma bewegendes Fluorophor entschieden. Das Protein ist abundant und man kann so die Zellplasmagrenzen gut erkennen. Momentan arbeiten wir mit angehefteten Fluorophoren, um auch nur an bestimmten Stellen vorhandene Proteine darzustellen. Das Potential ist immens. Demnächst wird so die Proteinverteilung in den Dornen auf der Nanometerebene beobachtet werden können. 

Die STED-Mikroskopie hat aber auch Grenzen, die von den Eigenschaften des Fluorophors abhängig sind. Dabei ist entscheidend, wie gut sich der Farbstoff an- und ausschalten lässt. Für STED gilt: Wenn ich das STED-Licht anmache, geht das Fluorophor automatisch sofort aus. Die sogenannte abregungsstimulierte Emission ist ein Prozess, der unter einer Femtosekunde abläuft. Etwas anders läuft das bei einer Weiterentwicklung unseres Labors, der RESOLFT-Mikroskopie (engl. reversible saturable optical (flurorescence) transitions), ab. Ein durch zwei, drei Mutationen schaltbar gemachtes Fluorophor kann durch photoinduzierte Isomerisierung ständig reversibel in einen leuchtenden und wieder zurück in einen nicht leuchtenden Zustand geschalten werden. Diese Prozesse verlaufen langsamer und benötigen daher eine geringere Lichtleistung. Für die Beobachtung der Dornen ist das zwar nicht nötig, wenn man aber eine noch höhere Auflösung möchte, dann wird die RESOLFT-Mikroskopie interessant. 


Stefan Hell
ist Direktor am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen und wurde 2014 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.

Kontakt: 
Stefan W. Hell, shell[at]gwdg.de
Arbeitsgruppe am Göttinger MPI

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Heft 3/2012

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