Thema:

Blitzlicht

Hochaufgelöste in vivo 3D-Zeitserien mittels SIM

Die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (engl.: structured illumination microscopy, SIM) kann die räumliche Auflösung eines Mikroskops verdoppeln. Die Methode ist sehr licht-effizient, aber bisherige Umsetzungen dieser Technik waren zu langsam, um Zellen live in 3D beobachten zu können. Dank neuer elektro-optischer Modulatoren und schneller Kameras ist es nun Forschern um Mats Gustafsson gelungen, 3D-Zeitserien von lebendigen Zellen in verschiedenen Farben mit verdoppelter Auflösung aufzunehmen.

Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein unersetzliches Instrument in der Biologie und den Lebenswissenschaften, da sie minimal-invasive, dreidimensionale Abbildungen von lebendigen Zellen in ihrer natürlichen Umgebung ermöglicht. Die Einführung von Fluoreszenz-Markern, allen voran GFP, führte zu molekularer Spezifität und ermöglichte somit das „Einfärben“ von verschiedenen Organellen und anderen Zellstrukturen mit extrem hohem Kontrast. 

Unglücklicherweise ist das räumliche Auflösungsvermögen von optischen Mikroskopen stark eingeschränkt. Ernst Abbe bewies 1873, dass zwei Punkte, die näher als l/(2 NA) nebeneinander liegen, nicht mehr unterscheidbar sind. Lambda ist dabei die Wellenlänge des Lichtes und NA die Numerische Apertur des Objektivs. 

Abbes Diktum umgangen

Allerdings hat Abbe nicht die Fluoreszenzmikroskopie berücksichtigt, sondern nur die Transmissions- oder Reflexionsmikroskopie. Fluoreszenz-Emissionen sind proportional zur Intensität des Anregungslichts. Regt man eine Probe mit „Flutlicht“ uniform an, dann resultiert in der Tat eine begrenzte Auflösung gemäß Abbe. Allerdings kann man das Anregungslicht auch formen und ihm eine Struktur geben. Konfokale Mikroskopie ist ein gutes Beispiel dafür: Die Anregungsstruktur ist ein fokussierter Laserstrahl. Zusammen mit einer Lochblende (engl.: pinhole) ergibt sich schließlich eine höhere dreidimensionale Auflösung. Um die Jahrtausendwende demonstrierte Mats Gustafsson auf beeindruckende Weise, dass eine sinusoidale, stehende Welle als Anregungsstruktur noch höhere Auflösungen ermöglicht – die strukturierte Beleuchtung (engl.: structured illumination) war geboren. Beim Einsatz der Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) wird die Probe mit einem sehr feinen sinusoidalen Streifenmuster angeregt und dabei ein Bild aus der resultierenden Fluoreszenz-Emission aufgebaut. Die Streifen kodieren dabei räumliche Informationen der Probenstruktur, die mit normaler Mikroskopie nicht auflösbar sind. Mit geeigneten Streifenmustern lässt sich die Auflösung eines Mikroskopes in allen drei Dimensionen um den Faktor 2 erhöhen1. Dies resultiert in einer Auflösung von lateral (in x,y-Richtung) 110 nm, axial (in z-Richtung) 360 nm für grüne Emissionen2. Der Preis für die erhöhte Auflösung ist allerdings, dass für die dreidimensionale, strukturierte Beleuchtung pro Fokusebene 15 Bilder mit unterschiedlichen Postionen des Streifenmusters aufgenommen werden müssen. 

SIM – die Vorteile

Dies war auch lange Zeit ein Grund, dass strukturierte Beleuchtung nur für fixierte Zellen eingesetzt wurde, für das live imaging waren die experimentellen Mikroskope schlicht zu langsam. Allerdings blieb das Interesse groß, strukturierte Beleuchtung auch für lebendige Zellen einzusetzen. Im Vergleich zu anderen superauflösenden Techniken bietet sie nämlich einige Vorteile: 

I Sie ist sehr effizient in der Beleuchtung und bei der Detektion von Fluoreszenz und kann daher auch bei einer sehr geringen Laserleistung zum Einsatz kommen. Das ist insofern wichtig, als dass die Zellen so in ihrer Funktion nicht beeinträchtigt werden. 

I Es werden keine speziellen Fluorophore benötigt. Alle Fluorophore, die in normaler Weitfeld- oder Konfokalmikroskopie funktionieren, sind auch für die strukturierte Beleuchtung geeignet.

I Im Gegensatz zur konfokalen Mikroskopie, bei welcher ein Laserpunkt durch die Probe geleitet wird, werden bei der strukturierten Beleuchtung viele Probenpunkte parallel gescannt. Auch die Detektion erfolgt parallelisiert. Mit den neuen SCMOS-Kameras (komplementärer Metalloxid-Halbleiter, engl.: scientific complementary metal oxide semiconductor) mit 5 Megapixeln können mittels strukturierter Beleuchtung extrem große Bildfelder in hoher Bildfolge aufgenommen werden.

Aufbau des Experiments

Um strukturierte Beleuchtung für das live imaging einsetzen zu können, haben wir ein Mikroskop mit extrem schnellen, elektro-optischen Wandlern und einer schnellen SCMOS-Kamera entwickelt (Abb. 3)2. Dabei werden auf einem Display, ähnlich denen in einem Fernseher oder Projektor (nur etwas schneller), die Streifenmuster in schneller Folge abgespielt und mittels verschiedener Laserquellen in die Objektebene des Mikroskopes projiziert. Die Umschaltzeit beträgt hierbei weniger als eine Millisekunde. Somit ist es nun möglich, ein Volumen von 100 x 100 x 1 Mikrometer in weniger als einer Sekunde aufzunehmen. Um einen zweifarbigen Datensatz aufzunehmen, muss dieser Vorgang wiederholt werden, da für unterschiedliche Anregungswellenlängen unterschiedliche Streifenmuster auf dem Display abgespielt werden müssen. Eine Mehrfarben-Aufnahme ist daher immer seriell.

In den Abbildungen 1 und 2 sind dreidimensionale Projektionen maximaler Intensität (engl.: maximum intensity projection) eines Datensatzes einer HeLa-Zelle abgebildet. Dabei wurde das Aktin-Skelett mit dem Fluoreszenz-Marker tdTomato rot und die Clathrin-überzogenen Vesikel (engl.: Clathrin-coated vesicles, CCV) mit mEmerald grün eingefärbt. Die Abbildungen 4 und 5 zeigen eine Zeitserie von einer HeLa-Zelle. Hier wurde abermals das Aktin-Zellskelett mit TdTomato eingefärbt und darüber hinaus die Mitochondrien mit MitoTracker Green. Es sind wieder dreidimensionale Projektionen der Datensätze dargestellt. Mit der erhöhten Auflösung von 3D-SIM lassen sich interne Strukturen der Mitochondrien live verfolgen. Diese Strukturen sind zum  Beispiel innere Membranen, die sogenannten Christae. Normalerweise sind Christae nur unter dem Elektronenmikroskop zu sehen, allerdings ist dies dann alles andere als live.

Momentan können solche dreidimensionalen Abbildungen von ganzen, lebendigen Zellen nur mit strukturierter Beleuchtung in hoher Auflösung live aufgenommen werden. Andere Techniken mögen zwar noch höhere Auflösungen erreichen, sind aber entweder deutlich langsamer oder nicht in der Lage, solch große Bildfelder abzudecken wie die hier vorgestellte Methode3,4. Durch die geringe Laserstrahlung bei strukturierter Beleuchtung werden die Zellen auch insgesamt weniger in ihrer Funktion beeinträchtigt. Außerdem werden die Farbstoffe langsamer ausgeblichen. Dadurch kann die Zelle über sehr lange Zeit beobachtet werden, andere Techniken bleichen die Zellen hingegen bis zu zehnmal schneller aus. So konnten beispielsweise bis zu 100 aufeinander folgende Aufnahmen einer lebenden Zelle gemacht werden, wobei eine Aufnahme aus 360 bis 720 Einzelbildern besteht.

Fazit

Die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung stellt damit einen guten Kompromiss zwischen räumlicher und zeitlicher Auflösung dar. Biokompatibilität, eine hohe Aufnahmerate, ein großes Bildfeld und minimale Laserbestrahlung – alles Qualitäten, die benötigt werden, um Zellen live zu beobachten. Wir glauben daher, dass SIM eine wichtige Rolle in der Biologie spielen wird und dabei helfen kann, wichtige Fragestellungen zu beantworten.

Literatur

[1] Gustafsson M.G.L., et al, Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination, Biophysical Journal, Volume 94, Issue 12, pp 4957-4970, 2008
[2] Fiolka R., Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination  PNAS 109 (14) pp 5311-5315, 2012 
[3] Jones SA, et al,  Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat Methods 8:499–508, 2011
[4] Westphal V, et al, Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. Science 320 pp 246–249, 2008

Korrespondenzadresse

Dr. rer. nat. Reto Fiolka 
Howard Hughes Medical Institute 
Janelia Farm Research Campus 
19700 Helix Drive
20147 Ashburn, Virginia, USA

Tel.: +1-(0)571-209-4000-3027
fiolkar[at]janelia.hhmi.org

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