Thema: Laborautomation

Direktnachweis von Viren und Bakterien im Stuhl

Stuhlproben stellen wegen ihrer Inhomogenität und komplexen Zusammensetzung besondere Herausforderungen an die Präanalytik. Am Beispiel von Noroviren und C. difficile werden Probleme und Lösungen des direkten Erregernachweises mit dem QIAsymphony RGQ System vorgestellt.

Virale und bakterielle Enteritiden gehören zu den am häufigsten kodierten Krankheiten im deutschen DRG-System. Unter den viralen Erregern hat das Norovirus als Auslöser epidemieartiger Brechdurchfälle besondere Bedeutung, während unter den bakteriellen Enteritiserregern Clostridium difficile als verbreitetster Erreger von Durchfallerkrankungen im stationären Bereich eine große, leider aber oft unterschätzte Rolle spielt. Das Norovirus ist nach dem Ort seiner Erstbeschreibung (Norwalk, Ohio) benannt. Es gehört zu den einsträngigen, unbehüllten RNA-Viren, die besonders gut als infektiöse Partikel in unbelebter Natur und bei extremen Temperaturschwankungen überdauern können. In Krankenhäusern oder Alten- und Pflegeheimen treten Infektionen mit Noroviren endemisch gehäuft auf. Die Ansteckung erfolgt in der Regel über Kontakt- beziehungsweise Schmierinfektion. Der letzte große Ausbruch war im Herbst 2012 in Ostdeutschland; er wurde durch Tiefkühlerdbeeren aus China ausgelöst. Betroffen waren mehr als 11.000 Personen, vor allem in Gemeinschaftseinrichtungen wie Altenheimen und Kindertagesstätten.

C. difficile ist ein anaerober, grampositiver Keim, der zur normalen Darmflora gehören kann. Erst wenn diese durch Antibiotikatherapie (vor allem Clindamycin, Cephalosporine und Chinolone) zurückgedrängt wird oder das Immunsystem des Patienten durch eine schwere Primärerkrankung beziehungsweise Immunsuppressiva geschwächt ist, kann er sich ausbreiten und durch seine Toxine eine schwere, teils sogar lebensbedrohliche Gastroenteritis verursachen.

Protein oder Nukleinsäure?

Stuhlproben sollten möglichst zeitnah auf Noroviren und C. difficile-Stämme, die ein Toxin-Gen tragen, untersucht werden. Traditionell wurden diese Erreger mit Enzymimmunoassays (EIA) nachgewiesen, wobei meist keine Unterscheidung der relevanten Genotypen von Norovirus I und II beziehungsweise C. difficile möglich war. Der Ausschluss einer Kolonisation mit C. difficile erfolgte früher meist in einem mehrstufigen, zeitaufwendigen Verfahren: Zuerst wurde ein GLDH-EIA als Suchtest eingesetzt, danach erfolgte der Toxinnachweis mittels A/B-EIA. Da Nukleinsäure-basierte Nachweisverfahren gegenüber den EIA deutliche Vorteile hinsichtlich Sensitivität und Spezifität aufweisen, haben sie in den letzten Jahren große Verbreitung gefunden und sind nun dabei, die Immunoassays als Erregernachweis mehr und mehr zu verdrängen.

Probenvorbereitung

Die heutigen PCR-basierten Nachweissysteme kombinieren eine Magnetpartikel-basierte DNA-bzw. RNA-Extraktion im Automaten mit dazu harmonierenden Real-Time-PCR-Geräten. Da in der medizinisch-mikrobiologischen Routinediagnostik neben den Noroviren und C. difficile noch weitere Viren, Bakterien und Parasiten eine wesentliche Rolle spielen, ist eine möglichst rationale und kosteneffiziente Strategie für die Probenaufarbeitung besonders wichtig, um eine zeitnahe Befunderstellung zu gewährleisten.

Der QIAsymphony SP/AS ist eine vollautomatisierte Plattform für die Nukleinsäureextraktion und den PCR-Setup. Die eigentliche Real-Time-PCR kann mit dem Qiagen Rotor-Gene Q (RGQ) oder auf 96-Well-Platten basierende Cycler implementiert werden. Im Folgenden soll ein von MVZ entwickeltes Prozedere vorgestellt werden, das es erlaubt, aus einer Nukleinsäureextraktion den Nachweis auf Noroviren und Clostridium difficile zu führen.

Extraktionsprotokoll

Zirka 0,1 g Stuhlprobe werden in 1 ml UniversalTransportMedium UTM (Copan Italia S.P.A.) suspendiert. Das UTM besteht aus einem mit Medium gefüllten Röhrchen, das zusätzlich Glasperlen enthält, um eine bessere Durchmischung der Probe zu erzielen. Durch Zentrifugation (10 Min., 1.600 x g) werden größere Stuhlbestandteile (zum Beispiel Pflanzenfasern) sedimentiert. Der Überstand der zentrifugierten Proben kann nach dem Öffnen der Röhrchen direkt im QIAsymphony SP zur Nukleinsäure-Extraktion eingesetzt werden. Das hierbei zum Einsatz kommende QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini Kit gewährleistet eine optimale Nukleinsäureextraktion aus unterschiedlichsten Probenmaterialien.

Auf Anraten der Qiagen-Applikationsspezialisten wurde der optional einsetzbare ATL-Puffer hinzugefügt, um eine generalisierte Lyse zu erhalten. Außerdem wurde das originale Extraktionsprotokoll (Pathogen Complex 200) so angepasst, dass das Probenmaterial ohne vorheriges Mischen direkt von der Flüssigkeitsoberfläche eingesetzt werden kann. Eine Trennung von Überstand und Pellet ist nicht mehr erforderlich, womit ein Pipettierschritt sowie Verbrauchsmaterial eingespart werden können.

Datenmanagement

Das adaptierte Protokoll mit der Bezeichnung „complex-200cr-212tid155_v1“ ist auf der Qiagen-Homepage verfügbar. Die Primärproben mit den Originalpatientenbarcodes können direkt in das QIAsymphony-System mit integriertem Barcodeleser für Primärproben eingesetzt werden, wodurch eine hohe Prozess-Sicherheit erreicht wird. Mit der neu entwickelten QIAlink-Software in Kombination mit der QIAsymphony Management Console ist außerdem das Datenmanagement zwischen dem QIAsymphony SP/AS und bis zu drei Rotor-Gene Q Cyclern mit dem Laborinformationssystem C-LAB von der Probe bis zur Befundung vollständig automatisiert. Nach zirka 80 Minuten (24 Proben) stehen die Totalnukleinsäureisolate für den Nachweis von Bakterien und DNA- oder RNA-Viren zur Verfügung.

Für die PCR-Reaktion werden die QuantiFast-Multiplex-PCR beziehungsweise RT-PCR-Kits von Qiagen verwendet. Verschiedene Real-Time-PCR-Geräte lassen sich für die eigentliche Amplifikation und Detektion einsetzen, allen voran der Rotor-Gene Q oder auch Cycler, die 96 Well-Platten aufnehmen können. Zusammen mit dem technischen Support der Firma Qiagen konnte die QIAsymphony RGQ-Plattform hervorragend an die Arbeitsabläufe und Bedürfnisse im Labor angepasst und in das lokale LIMS-System integriert werden.

Das beschriebene Vorgehen zum Viren- und Bakteriendirektnachweis aus Stuhlproben lässt sich leicht in den bestehenden Laborablauf integrieren. Die verwendeten Reagenzien erlauben im Multiplex-Ansatz den Nachweis weiterer relevanter Erreger wie zum Beispiel EHEC, Adenoviren, Enteroviren und Helicobacter pylori, so dass eine den modernen Bedürfnissen angepasste Stuhldiagnostik mit gleichzeitig hoher Analysenqualität bei geringer Personalbindung und hoher Kosteneffizienz ermöglicht wird.

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