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RGB marking: Vielfarbige Zellmarkierung zur klonalen Analyse

Lentivirale Vektoren integrieren in das Zielzellgenom und erlauben so die permanente Markierung genetisch modifizierter Zellen und ihrer Nachkommen. Kodieren die eingebrachten Vektoren für Fluoreszenzproteine, lassen sich markierte Zellen anhand der emittierten Fluoreszenz im Mikroskop oder mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) identifizieren. 

Wir konnten kürzlich zeigen, dass die simultane lentivirale Expression dreier Fluoreszenzproteine (Rot, Grün, Blau = RGB marking) im Einklang mit dem additiven Farbmodell zur Generierung spezifischer Mischfarben führt, welche an die Tochterzellen vererbt und so zu einer klonalen Eigenschaft werden. Darauf aufbauend eignet sich das RGB marking mit lentiviralen LeGO-Vektoren für die Verfolgung von Zellklonen sowohl im Rahmen der normalen Regeneration als auch der Kanzerogenese.

Von Retroviren abgeleitete Vektoren haben sich als vielseitige Werkzeuge für die zellbiologische Forschung und die Gentherapie erwiesen. Ihre stabile Integration in das Zielzellgenom erlaubt die in vitro- und in vivo-Untersuchung langfristiger Effekte der Expression eingebrachter Transgene1. Auch für viele Anwendungen in der Gentherapie ist eine stabile Langzeitexpression des eingebrachten, therapeutischen Gens essentiell2.  Umgekehrt können retrovirale Vektoren auch benutzt werden, um interessierende Gene über lange Zeiträume mit Hilfe der RNA-Interferenz abzuschalten oder herunterzuregulieren3. Allerdings ist die weitgehend ungerichtete Integration retroviraler Vektoren in das Zielzellgenom mit dem Risiko der unbeabsichtigten Aktivierung oder Zerstörung betroffener Genloci durch Insertionsmutagenese verbunden, welche im ungünstigsten Fall zur malignen Transformation der Zelle führen kann4

Um das Risiko der Insertionsmutagenese zu minimieren, wurde die Architektur retroviraler Vektoren dahingehend optimiert, dass die starken viralen Promotoren und Enhancer aus den long terminal repeats (LTRs) entfernt wurden. Die Entwicklung solcher selbst-inaktivierenden (SIN-)Vektoren mit nicht-viralen Promotoren hat zu einer signifikanten Verringerung des Risikos der Insertionsmutagenese im Tiermodell geführt5,6.

 

LeGO-Vektoren und Fluoreszenzproteine zur Zellmarkierung

Eine weitere Möglichkeit der Risikoverringerung ist die Entwicklung von Vektoren auf Basis von Retroviren, die ein anderes Integrationsmuster aufweisen. So hat sich gezeigt, dass die als Ausgangsbasis für retrovirale Vektoren der ersten Generation benutzten γ-Retroviren vom MLV-Typ (MLV = Murines Leukämievirus) eine Tendenz zur verstärkten Integration in Promotor- und Enhancerregionen von Genen aufweisen, die als besonders anfällig für die Insertionsmutagenese gelten7. Dagegen integrieren vom Humanen Immundefizienzvirus (HIV) abgeleitete, lentivirale Vektoren1 bevorzugt in transkribierte Sequenzbereiche außerhalb der Promotor- und Enhancerregionen8

Andere, wie die α-Retroviren, scheinen sogar ein völlig neutrales Integrationsbild zu zeigen, was sie zu vielversprechenden Kandidaten für die Vektorentwicklung macht9.

Lentivirale (SIN-) Vektoren werden aufgrund ihrer sehr hohen Effizienz in den unterschiedlichsten Zellsystemen und des angesprochenen geringeren Risikos einer Insertionsmutagenese derzeit in vielen Labors für die Transgenese benutzt. Wir haben kürzlich ein modulares Vektorsystem entwickelt, welches dem Baukastenprinzip folgt. Diese „lentiviralen Gen-Ontologie“(LeGO)-Vektoren erlauben die permanente Überexpression sowie die Herunterregulation von zu untersuchenden Genen10, 11.

Eine weitere, sehr interessante Anwendung der LeGO-Vektoren ist die permanente Zellmarkierung. Die Markierung und die damit verbundene Wiedererkennbarkeit von Zellen und deren Tochterzellen hat wesentlich zu einem besseren Verständnis normaler Regenerationsprozesse sowie der Entstehung und Entwicklung maligner Krankheiten beigetragen12. Einen dauerhaften Entwicklungsschub für Markierungsansätze brachte in diesem Kontext die 2008 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnete Entdeckung fluoreszierender Proteine und ihre Entwicklung als Markergene13, 14. Allerdings ist trotz einer Vielzahl neu beschriebener Fluoreszenzproteine die Zahl unterschiedlicher und tatsächlich unterscheidbarer Marker auf eine Handvoll beschränkt15. Praktisch bedeutet dies zum Beispiel, dass auf der Basis einer permanenten Zellmarkierung mit den vorhandenen Fluoreszenzproteinen zwar die Organregeneration als ganzes, nicht jedoch der tatsächliche Beitrag einzelner Zellklone visuell nachvollziehbar ist16.

Genau der Beitrag distinkter Zellklone zur normalen Gewebsregeneration und zur überschießenden Regeneration und dem Auswachsen maligner Tumoren war es, der uns interessierte – vor allem im Rahmen eines Projektes des SFB841 „Leberentzündung: Infektion, Immunregulation und Konsequenzen“. Daher standen wir vor der Aufgabe, mit der vorhandenen, begrenzten Zahl unterscheidbarer Fluoreszenzproteine eine möglichst unbegrenzte Zahl unterschiedlicher Zellklone definitiv identifizierbar zu machen. Eine Lösung dieses Paradoxons ergab sich aus der additiven Farbenlehre. Danach lässt sich in einem dreidimensionalen Farbraum aus den drei Grundfarben (Rot, Grün und Blau, RGB) jede beliebige Mischfarbe generieren (Abb. 1a, b). Dieses Verfahren der Farbmischung aus den Grundfarben wird zum Beispiel auch in Fernsehern und Computerbildschirmen verwendet. Die Frage war, ob sich das RGB-Prinzip auch auf die LeGO-Vektor vermittelte Expression dreier Fluoreszenzproteine in lebenden Zellen anwenden lässt (Abb. 1c). 

Um dies zu testen, benutzten wir drei LeGO-Vektoren, die für jeweils ein Fluoreszenzprotein kodierten: LeGO-C2 für mCherry (Rot), LeGO-V2 für Venus (Gelbgrün) und LeGO-Cer2 für Cerulean (Blau). Die Transduktion der Zielzellen erfolgte gleichzeitig mit allen drei Vektoren mit zuvor berechneten identischen Mengen infektiöser Partikel (sog. MOI = Multiplizität der Infektion). Die MOI war dabei so eingestellt, dass mit jedem einzelnen der drei Vektoren ca. 50% aller Zellen transduziert wurden. Somit waren aus kombinatorischer Sicht acht verschiedene Gruppen transduzierter Zellen zu erwarten, die jeweils 12,5% aller Zellen umfassen sollten17. Vier dieser Gruppen waren durch die Expression mindestens zweier unterschiedlicher Fluoreszenzproteine charakterisiert und ließen mithin die für das RGB marking notwendige Entstehung von Mischfarben erwarten. 

Eine grundlegende Voraussetzung für die Vielfalt der generierten Mischfarben bestand darin, dass die zu mischenden Grundfarben in unterschiedlichen Intensitäten vorliegen. Beim RGB marking mit LeGO-Vektoren sollte dies durch zwei wichtige Parameter des Gentransfers gewährleistet werden: Erstens, kann bei Gentransferraten von mehr als 50% pro Vektor davon ausgegangen werden, dass in einzelnen Zellen die Zahl der Vektorinsertionen für jede Farbe zwischen eins und drei variiert18, 19. Zweitens ist bekannt, dass die Integrationsstelle eines Vektors einen signifikanten Einfluss auf die Expression des eingebrachten Transgens hat19.Die entscheidende Frage war, ob diese beiden Parameter zusammengenommen nicht nur hochspezifisch für eine gegebene Zelle sind, sondern auch an alle Tochterzellen weitergegeben werden und somit einen klonalen Marker darstellen. 

Wie erste Analysen in vitro mit HEK293T-Zellen zeigten, erlaubte das RGB marking tatsächlich die Identifikation von Zellklonen anhand der spezifischen Farbe, die allen Zellen des Klons gemein war (Abb. 1d)17. Dabei werden die verschiedenen Zellklone anhand ihrer individuellen Farbe im Fluoreszenzmikroskop direkt sichtbar gemacht, ohne dass die Zellintegrität zerstört werden muss (Abb. 1d). Damit ist eine Klonalitätsanalyse in sehr kurzer Zeit möglich.

Im nächsten Schritt war die für die Anwendbarkeit des RGB marking entscheidende Frage der Farbkonstanz in vivo zu klären. Eines der von uns dazu benutzten Modelle basierte auf der seriellen Transplantation von RGB-markierten karzinogenen BON-Zellen. Wie erwartet hatten die RGB-markierten BON-Zellen in primären Rezipienten Lebertumoren gebildet, die in der Mehrzahl aus Zellen ein- und derselben Farbe bestanden (Abb. 2a)17. Allerdings waren auch einige „Mischtumoren“ nachweisbar (Abb. 2a)17. Wir explantierten einige der monochromen Tumoren, vereinzelten die Zellen und nahmen diese in Kultur. Wie wir zeigen konnten, wiesen alle aus einem Tumor isolierten Zellen über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg dieselbe Farbe wie der Ursprungstumor auf (Abb. 2b)17. Wurden diese Zellen in sekundäre Rezipienten transplantiert, entstanden erneut Tumoren, die durch die gleiche RGB-Farbe wie der Ausgangstumor charakterisiert waren (Abb. 2c)17. Mischten wir für die Transplantation RGB-markierte Zellen, die von zwei unterschiedlichen Tumoren abstammten, entstanden in den Sekundärrezipienten sowohl monochrome Tumoren, die den beiden Ausgangstumoren entsprachen, als auch zweifarbige Tumoren, die aus Zellen beider Ausgangstumoren bestanden (Abb. 2d)17. Folglich haben nicht die Zellen innerhalb eines Tumors in vivo ihre Farbe geändert, sondern mehrfarbige Tumoren sind aus mehreren Zellen verschiedener Farbe entstanden. Mit diesen sowie damit einhergehenden molekularbiologischen Untersuchungen (Abb. 2e) konnten wir nachweisen, dass das RGB marking eine klonale, langfristige und eindeutige Zellmarkierung in vivo ermöglicht17.

Insgesamt ist es uns gelungen, mit dem RGB marking eine neue Methode der klonalen Zellmarkierung zu entwickeln, die für unterschiedlichste Anwendungen sowohl in Modellen der regenerativen Medizin als auch der Kanzerogenese von großem Interesse sein dürfte.

Danksagung

Wir möchten uns bei vielen Kollegen bedanken, die uns mit Zellen und Konstrukten unterstützt haben: H. Wege (Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf) für FH-hTERT Zellen, R.Y. Tsien (Howard Hughes Medical Institute) mCherry cDNA, A. Miyawaki (RIKEN) und T. Schroeder (Institute for Stem Cell Research) Venus cDNA und D.W. Piston (Vanderbilt-Ingram Cancer Center) für Cerulean cDNA. Durchflusszytometrie wurde in der FACS Sorting Core Unit des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf durchgeführt. Konfokale Mikroskopie wurde mit Hilfe von O. Bruns (Heinrich-Pette-Institut Hamburg) in Zusammenarbeit mit dem Nikon Application Center Norddeutschland durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB841 an B.F. und D.B.) und die Nachwuchsförderung des Forschungsförderungsfonds der Medizinischen Fakultät Hamburg (NWF-12/09 an K.W.).

Literatur

[1] Naldini, L. et al., Science 272 (1996), 263-267

[2] Alexander, B.L. et al., Gene Ther. 14 (2007),1439-1447

[3] Singer, O., Verma, I.M., Curr Gene Ther. 8 (2008), 483-488

[4] Baum, C. et al., Hum Gene Ther. 17 (2006), 253-263

[5] Cornils, K. et al., Mol Ther. 17 (2009), 131-143

[6] Zychlinski, D. et al., Mol Ther. 16 (2008), 718-725

[7] Wu, X. et al., Science 300 (2003),1749-1751

[8] Wang, G.P. et al., Genome Res. 17 (2007), 1186-1194

[9] Suerth, J.D. et al., J Virol. 84 (2010), 6626-6635

[10] Weber, K. et al., Mol Ther. 16 (2008), 698-706

[11] Weber, K. et al., Gene Ther. 17 (2010), 511-520

[12] Barese, C.N., Dunbar, C.E., Hum Gene Ther. 22 (2011),
659-668

[13] Giepmans, B.N. et al., Science 312 (2006), 217-224

[14] Chalfie, M., PNAS USA, 106 (2009), 10073-10080

[15] Shaner, N.C. et al., Nat Methods 2 (2005), 905-909

[16] Vafaizadeh, V. et al., Stem Cells 28 (2010), 928-938

[17] Weber, K. et al., Nat Med. 17 (2011), 504-509

[18] Fehse, B. et al., Gene Ther. 11 (2004), 879-881

[19] Kustikova, O.S. et al., Blood 102 (2003), 3934-9397

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