Thema:

Zellanalyse

Isolierung zirkulierender Tumorzellen

Die Analyse der Menge zirkulierender Tumorzellen im Blut ermöglicht die Kontrolle des Erfolges einer Krebstherapie sowie die Überwachung des Tumorwachstums. Doch die Konzentration der Zellen im Blut ist niedrig, so dass ihre Anreicherung oder Isolierung erforderlich ist. Mikrofluidik-Chips zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen werden in naher Zukunft eine wichtige Rolle beim Therapiemonitoring von Krebserkrankungen spielen.

In miniaturisierten Fluid-Kanälen bilden magnetische Partikel Ketten, deren Abstand sich durch gezielte magnetische Quellenfelder manipulieren lässt. Die so entstandene Struktur eignet sich als Filter zur Isolierung der zirkulierenden Tumorzellen. Der hier vorgeschlagene Chip kombiniert die mechanische und die biomagnetische Filterung. Mit Hilfe von Computersimulation kann der Chip entwickelt und optimiert werden.

Im Blut zirkulierende Tumorzellen (circulating tumor cells, CTCs) können für eine effektive und zielgerichtete Behandlung von Krebserkrankungen von Nutzen sein. Sie lösen sich vom Primärtumor und gelangen in den Blutkreislauf. Von dort können sie auch weitentfernte Organe erreichen. Aus diesem Grund entstehen oft tödliche Metastasen auch nach erfolgreicher Beseitigung eines Krebsgeschwürs. Durch die erstmalige Beobachtung (1869) dieser den Tumorzellen ähnelnden Zellen ergab sich ein neues diagnostisches Potential1. Lange war es jedoch nicht möglich, zirkulierende Tumorzellen erfolgreich aus dem Blutstrom zu extrahieren. Allein durch die Abschätzung der Zahl der im Blut zirkulierenden Tumorzellen können Rückschlüsse auf den Status der Tumorerkrankung gezogen werden. Eine genauere Analyse einzelner Zellen führt zusätzlich zu einem verbesserten Verständnis der Biologie der verschiedenen Krebsarten und Metastasen. Der geringe Anteil an erkrankten Zellen im Blut erschwert aber die erfolgreiche Filterung. Es befindet sich nur etwa eine zirkulierende Tumorzelle unter mehreren hundert Millionen Blutzellen.

Existierende Extraktionsmethoden für zirkulierende Tumorzellen

In den letzten Jahren hat die Krebszellforschung erhebliche Fortschritte gemacht, auch bei der Analyse zirkulierender Tumorzellen. Es ist bereits möglich, einzelne Zellen aus dem Blut zu filtern und zu analysieren. Der Aufwand – sei es an Zeit oder an Geldmitteln – ist aber meist noch enorm. Es werden verschiedenste Technologien ineinander geschachtelt, um mit einzelnen Zellen arbeiten zu können. Im Fall der zirkulierenden Tumorzellen heißt das, dass durch mehrere Filtervorgänge die Zahl der nicht gesuchten Blutzellen stetig verringert wird.

Der einfachste Ansatz der Filterung ist physikalischer Natur. Dazu wird der Größen- und Elastizitätsunterschied zwischen entarteten und gesunden Zellen genutzt. Zirkulierende Tumorzellen sind normalerweise etwas größer und lassen sich weniger deformieren als zum Beispiel rote Blutkörperchen. Dieses Wissen führte unter anderem zu mechanischen Membranfiltern2. Einige weiße Blutkörperchen überschneiden sich aber in der Größenbandbreite mit den CTCs. Das führt zu nicht-eindeutigen Ergebnissen in der Filterausbeute – das Verhältnis zirkulierender Tumorzellen zu den restlichen Blutzellen wird also zwar minimiert, aber sie werden nicht vollständig voneinander getrennt.

Eine weitere Möglichkeit zur CTC-Aufreinigung ist der Einsatz von Antikörper-beschichteten Oberflächen, an denen das Blut vorbeigeführt wird. EpCAM-Proteine (epithelial cell adhesion molecule) können Tumorzellen epithelialen Ursprungs gezielt einfangen, während Blutzellen nicht an den Faktor binden. Tumorzellen anderen Ursprungs können durch spezielle Bindungsfaktor-Cocktails3 angereichert werden. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine zirkulierende Tumorzelle die spezielle Oberfläche berührt, ist dabei entscheidend für die erfolgreiche Extraktion. Eine Lösung ist die Generierung von Mikrosäulen in den Kanälen des CTC-Chips. Durch sie wird ein großes Oberflächen- zu Volumenverhältnis4 erzielt. Eine unregelmäßige Anordnung solcher Säulen erhöht die Kontaktwahrscheinlichkeit3. Ein zweiter Ansatz, die Wahrscheinlichkeit des Aufeinandertreffens des Fängermoleküls mit einer CTC zu erhöhen, kommt ohne Mikrosäulen aus. Fischgrätenförmige Muster an Wänden der Kanäle des CTC-Chips führen zu genügend Turbulenzen, um Kolli-sionen der „Fängermoleküle“ mit den zirkulierenden Tumorzellen herbeizuführen5. 

Um neuartige Antikörper für alle bekannten und noch unbekannten Tumorzellen zu finden, werden allerdings eine große Zahl an einzelnen zirkulierenden Tumorzellen benötigt. Erst nach erfolgreicher Charakterisierung aller Zellen kann eine optimale Ausbeute erfolgen. Das heißt aber, eine Affinitätsfilterung allein führt derzeit noch nicht zum gewünschten Resultat.

Kombination von Vorteilen

Durch unterschiedliche Abstände von funktionalisierten Mikrosäulen können die mechanische und Affinitäts-Filterung kombiniert werden6. Dadurch wird eine hohe Filter-effizienz erreicht. Unsere Forschungsgruppe an der Fachhochschule St.Pölten beschäftigt sich derzeit mit der Entwicklung eines Simulationstools für Microfluidik-Chips im Rahmen des Projekts „Tunable microfluidic chips for isolating circulating cancer cells“ der Life Science Krems GmbH. In dieser Arbeit werden magnetische Teilchen mit Antikörpern funktionalisiert. Mit Hilfe eines externen Magnetfeldes können dann gezielt Filterstrukturen, zum Beispiel in CTC-Chips, erzeugt werden. Durch die Kombination von mechanischen Filterketten und den affinen Partikeln lässt sich eine besonders gute Filtereffizienz erzielen.

Abbildung 1 zeigt den Ablauf einer Filterung von zirkulierenden Tumorzellen: 

a. Zu Beginn werden die oben erwähnten weichmagnetischen Partikel in einen Microfluid-Chip beliefert. Diese Teilchen sind mit speziellen Antikörpern beschichtet, an die die Tumorzellen sich anheften. 

b. Durch Anlegen eines magnetischen Gradientenfeldes bilden diese magnetischen Beads Ketten in genau definierten Positionen. Deren Abstände können durch Veränderung des Magnetfeldes gesteuert werden. 

c. Sobald diese Partikelketten in Position sind, beginnt die Zuleitung der Blutprobe. Durch die Kombination von Größenfilterung und Affinitätsbindung mit speziellen Antikörpern bleiben nur die zirkulierenden Tumorzellen haften. 

d. Diese können dann mit einem Mikroskop analysiert und für weitere Tests verwendet werden.

Optimierung der Filtereffizienz durch Simulationen

Wie auch in vielen anderen Bereichen können Computersimulationen das Verständnis von teuren, komplizierten oder schlecht erkennbaren Vorgängen verbessern. Alle derzeit verfügbaren Filtermethoden konnten bisher nur durch „trial-and-error“-Experimente entwickelt werden. Das führte zwar zu teilweise ansprechenden Resultaten, aber eine vollständige Trennung der Zellen konnte noch nicht erreicht werden. An der Fachhochschule arbeiten wir derzeit mit Hochdruck an einer Simulationsumgebung für einen vollständigen Filtervorgang zirkulierender Tumorzellen. 

Die Problemstellung verbindet Mikromagnetismus, Strömungs- und Zellularmechanik. EpCam-behaftete weichmagnetische Partikel bewegen sich in einem magnetischen Gradientenfeld. Im Zusammenspiel mit Kräften der Blutströmung kann die genaue Position der magnetischen Partikel im Mikrofluid-Chip berechnet werden. Dadurch können, wie in Abbildung 1 gezeigt, Kettenstrukturen erzeugt werden. Das Zusammenspiel eines homogenen und des Gradientenfeldes emöglicht zudem die Variation der Filterabstände zwischen diesen Ketten7.

Das Modell der Blutzelle wird als eine Oberflächenmembran mit interagierenden Teilchen beschrieben8. Ein spezielles Masse-Feder-System ermöglicht die genaue Nachbildung realer Strömungsbewegungen. Ein rotes Blutkörperchen besteht aus einem Zytoskelett und einer umschließenden Membran. Für die Computermodellierung wird nur die Membran zu Rate gezogen (Abb. 2a). 400 Oberflächenteilchen sind funktionell miteinander verbunden. 

Es wirken eine konstante Oberflächen- bzw. Volumenkraft, eine Federkraft und eine winkelabhängige Kraft. Mit einer optimalen Einstellung dieser vier Parameter kann ein nahezu reales Verhalten gesunder und kranker Blutzellen nachgestellt werden. Hauptaugenmerk werden auf das konstante Oberflächen und Volumen von Blutzellen gelegt. Den Rest erledigen Federkräfte zwischen den Teilchen und winkelabhängige Belastungen der Membranoberfläche. Zur Validierung werden die Modelle real durchgeführten Belastungsproben gegenübergestellt. Beispielsweise werden Blutzellen mit einer optischen Laserpinzette in die Länge gezogen9. Das Verhältnis von Längen- zu Breitendurchmesser bei konstanter Kraft ist ein wichtiger Faktor für ein korrektes Modell. In ähnlicher Weise lassen sich Krebzellen simulieren. Abbildung 2b zeigt die Deformation einer Brustkrebszelle beim Durchgang zwischen zwei Ketten aus magnetischen Partikeln.

Zusammenfassung und Ausblick

Die Zahl der Technologien zur Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen hat in den letzten Jahren stark zugenommen. Jede einzelne dieser Methoden scheitert aber derzeit noch an einer kompletten Trennung von den restlichen Blutzellen. Die Kombination von mechanischer und Affinitäts-basierter Filterung ermöglicht es, die Effizienz zu erhöhen. Für eine eindeutige Diagnose fehlt es aber an der Genauigkeit der erwähnten Mechanismen. Aufgrund der methodenabhängigen Ausbeute ist ein Vergleich verschiedener Technologien schwer möglich. Unser Team entwickelt derzeit eine Simulationsumgebung, um die Isolaterung zirkulierender Tumorzellen zu optimieren. Diese Resultate werden wichtige Erkenntnisse für den Bau zukünftiger „lab-on-a-chip“-Methoden liefern. Es werden dringend große Mengen an einzelnen Tumorzellen benötigt, um molekularbiologische Untersuchungen durchführen zu können. Der Bildung von Metastasen kann nur durch ausreichendes Wissen über die zirkulierenden Tumorzellen entgegengewirkt werden.

Danksagung

Die Autoren bedanken sich für aufschlussreiche Diskussionen mit Dr. Martin Pecherstorfer, Dr. Martin Brandl, Dr. Hubert Brückl und Dr. Ivan Cimrak und für die finanzielle Unterstützung der Life Science Krems GmbH. 

Literatur

[1] Ashworth, T. R (1869). „A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death“. Australian Medical Journal 14: 146–7.

[2] Lu B, Xu T, Zheng S et al. (2010) Parylene membrane slot filter for the capture, analysis and culture of viable circulating tumor cells. Proceedings of the IEEE 23rd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS):935–938

[3] Dickson MN, Tsinberg P, Tang Z et al. (2011) Efficient capture of circulating tumor cells with a novel immunocytochemical microfluidic device. Biomicrofluidics 5:034119-1–034119-15

[4] Nagrath S, Sequist LV, Maheswaran S et al. (2007) Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature 450:1235–1239

[5] Stott SL, Hsu CH, Tsukrov DI et al. (2010) Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc Natl Acad Sci USA 107:18392–18397

[6] Maimonis PJ, Merdek K, Dietenhofer K et al. (2010) Affinity and size capture of circulating tumor cells: a platform for increased sensitivity. Fourth AACR International Conference on Molecular Diagnostics in Cancer Therapeutic Development, Sep 27–30:B5

[7] Gusenbauer, Markus, Kovacs, Alexander, Reichel, Franz, Exl, Lukas, Bance, Simon, Özelt, Harald, and Schrefl, Thomas: Self-organizing magnetic beads for biomedical applications, Journal of Magnetism and Magnetic Materials 324(6), volume 324, 977–982, 2012

[8] M. Dupin, I. Halliday, C. Care, L. Alboul, Modeling the flow of dense suspensions of deformable particles in three dimensions, Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 75 (2007)

[9] S. Henon, G. Lenormand,A. Richert,F. Gallet,A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers (1999).doi:16/S0006-3495(99)77279-6

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