Thema:

Genome Engineering

Sequenzgenaues DNA-Targeting mit TAL-Tools

Transcription Activator-Like (TAL) Effektorproteine repräsentieren eine Klasse von Transkriptionsaktivatoren, die von verschiedenen Xanthomonas-Arten produziert und in ihre Wirtspflanzen injiziert werden. Mit der Entschlüsselung ihres DNA-Bindecodes und der Möglichkeit, unterschiedliche funktionelle Domänen von TALs zu fusionieren, wurde jetzt eine ganz neue Klasse von Werkzeugen für die Manipulation genetischer Information und Funktion hervorgebracht.

Transcription Activator-Like (TAL) Effektorproteine sind eine Klasse von Transkriptionsaktivatoren, die von verschiedenen Xanthomonas-Arten produziert und in ihre Wirtspflanzen injiziert werden. Dort wirken sie auf transkriptioneller Ebene auf die Expression bestimmter Wirtsgene, um ein für die Vermehrung der Bakterien förderliches zelluläres Milieu zu schaffen. Aus der Sicht des Genome Engineering interessieren dabei besonders die spezifischen Bindesequenzen, welche die TAL-Proteine nutzen, um die Wirtsgene zu manipulieren. Die Spezifität der Bindesequenzen ist in der Anordnung von Repeat-Domänen innerhalb des zentralen Bereichs von TAL-Effektoren verschlüsselt. Jede Repeat-Domäne kann ein bestimmtes Nukleotid binden, so dass die Reihenfolge der einzelnen Repeat-Domänen die zu bindende DNA-Sequenz definiert. Der Bindebereich vermittelt – zusammen mit einer Aktivator-Funktion und einem NLS (Nuclear Localization Signal) – den Kernimport und die Aktivierung bestimmter Promotoren. Mit der Entschlüsselung des Bindecodes und der Möglichkeit, unterschiedliche funktionelle Domänen zu fusionieren, wurde jetzt eine ganz neue Klasse von Werkzeugen für die Manipulation genetischer Information und Funktion hervorgebracht.

Die Menge verfügbarer genetischer Information ist bereits heute überwältigend groß und wächst aufgrund der rasanten Technologieentwicklungen im Bereich des Next Generation Sequencing unvermindert weiter. Die Auswertung der Sequenzdaten und die Überführung dieser Resultate in konkrete Anwendungen innerhalb der Biotechnologie oder Medizin erfolgt hingegen mit einer sehr viel geringeren Geschwindigkeit und Effizienz. Bisher waren die Möglichkeiten einer gezielten Manipulation genetischer Information aufwendig und die Umsetzung von Erkenntnissen aus Genomanalysen entsprechend limitiert. Bakterielle TAL-Proteine, die wie Transkriptionsfaktoren wirken, haben das Potential, eine ganz neue Dynamik in die gezielte Veränderung von Genomen verschiedenster Organismen zu bringen. 

TAL-Proteine lassen sich als molekulare Werkzeuge verwenden, um Genome zu manipulieren. So können beispielsweise Gene irreversibel ausgeschaltet, repariert oder Fremdgene eingeschleust werden. Aber auch die reversible Regulation der Genexpression ist möglich, indem Aktivatoren oder Repressoren mit Promotor-bindenden TALs fusioniert werden. Die Palette möglicher Anwendungen ist durch die einfache Handhabung, beziehungsweise den unkomplizierten Austausch der funktionellen Fusionsanteile relativ problemlos erweiterbar und neue Anwendungsfelder, beispielsweise im Bereich epigenetischer Modifikationen, sind absehbar. 

Der zentrale, aus Repeat-Domänen bestehende Bereich der TAL-Effektoren ist für die Bindung an die Zielsequenz verantwortlich. Natürlicherweise besteht dieser Bereich aus 12 bis 27 dieser Domänen. Jede Repeat-Domäne eines TAL-Proteins besteht aus durchschnittlich 34 Aminosäuren. Die spezifische Erkennung eines Nukleotids erfolgt über ein polymorphes Aminosäurepaar an Position 12 und 13 der sonst äußerst konservierten Repeat-Domäne, das als RVD (Repeat Variable Diresidue) bezeichnet wird. Die Entschlüsselung des natürlichen Codes, der jeder Repeat-Domäne ein Nukleotid in einer DNA-Sequenz zuweist, führte zur Entwicklung von Designer-TAL-Effektorproteinen. Diese bestehen aus mehreren Funktionseinheiten. So können unterschiedliche Funktionen, die in der Regel durch die Verknüpfung mit enzymatisch aktiven Domänen vermittelt werden, gezielt in zugängliche Regionen chromosomaler DNA dirigiert werden.

Die Entschlüsselung des TAL-Codes und die Entwicklung des Konzepts einer TAL-Technologieplattform (Abb. 1) erfolgte in Zusammenarbeit mit der Universität Halle1. Life Technologies entwickelte den Produktionsprozess für die Herstellung der Effektoren aus vorgefertigten Bausteinen. Seit März 2012 können kundenspezifische GeneArt® Precision TAL-Effektoren mit einer Lieferzeit von rund zwei Wochen bezogen werden.

Präzises Genome Engineering

Gezielte Veränderungen von Genomen betreffen bisher in der Regel einfache Gene-Knockouts, Gene Repairs, Genome-Rearrangements oder das gerichtete Einfügen von Fremd-DNA. In Abhängigkeit der jeweiligen Zielorganismen, wie Bakterien, Hefen, Algen, Pflanzen oder Säugetierzellen gibt es eine Reihe von Methoden, die sich in Aufwand und Effizienz erheblich unterscheiden. Während sich einfache Organismen, wie Bakterien, Hefen und manche Algen relativ gut manipulieren lassen, indem zelleigene Mechanismen wie die homologe Rekombination effizient genutzt werden, sind gezielte genomische Modifikationen gerade bei Pflanzen- und Säugetierzellen enorm aufwendig. Bisher standen mit Zinkfingernukleasen (ZFNs) und Homing-Endonukleasen zwei Technologien zur Verfügung, die eine DNA-bindende Einheit mit einer DNA-schneidenden Einheit zur gezielten Spaltung eines genomischen Locus verknüpfen. Das sequenzgenaue Targeting und das Einführen eines gezielten DNA-Doppelstrangbruchs ist die Voraussetzung, um mit Hilfe zelleigener Reparaturmechanismen die Zielsequenz zu verändern. Durch Non-homologous end-joining (NHEJ) kann die Spaltstelle wieder verknüpft werden, wobei es in der Regel zu ungenauen Verbindungen in Form von Nukleotid-Deletionen kommt. Diese Ungenauigkeit wird zum irreversiblen Ausschalten eines Gens verwendet, da sie zu einem Frameshift (Leserastermutation) und damit zu einem inaktiven Gen bzw. Protein führt. Weist ein Ziel-DNA-Fragment zu beiden Seiten der Spaltstelle homologe Sequenzbereiche auf, kann es über homologe Rekombination (HR) in das Genom integriert werden. Die TALENs (TAL-Endonuklease) sind in ihrem Funktionsmechanismus und ihrer Wirksamkeit vergleichbar mit ZFNs. Allerdings ist das Design und die Auswahl der Zielsequenzen bei der Verwendung von ZFNs weniger flexibel. Es hat sich gezeigt, dass die Wirksamkeit von ZFNs kontext- und positionsabhängig ist und sich die beiden ZFN-Moleküle in ihren Bindungs- und Funktionseigenschaften gegenseitig beeinflussen können. Aus den abgeleiteten Designregeln ergibt sich rechnerisch eine Targetfrequenz von etwa 500 Nukleotiden und damit keine nukleotidgenaue Festlegung der Zielsequenz, sondern nur die Einschränkung auf einen Bereich. TALs haben dagegen kaum Sequenzrestriktionen. Ein weiterer Nachteil von ZFNs: Die Effizienz lässt sich nicht gut prognostizieren, und unter Umständen müssen mehrere ZFN-Paare funktionell getestet werden, was sich auf die Herstellungskosten auswirkt. Auch für TALENs kann eine Vorselektion aus mehreren Paaren die Effizienz erhöhen. Allerdings hat sich gezeigt, dass die Erfolgsrate von etwa 5% bis 50% genomischer Mutationen ausreicht, um rekombinante Zelllinien kostengünstig herzustellen. Generell ist die Bindungsspezifität der ZFNs nicht hoch genug, um Off-Target-Effekte auszuschließen. Unerwünschte Nebeneffekte, inklusive toxischer Reaktionen, bleiben daher nicht aus. Im Vergleich weisen TAL-Effektoren nachweislich seltener unerwünschte Nebeneffekte durch Off-Target-Bindungen auf.

Die gezielte Erhöhung oder Reduktion der Expression eines Gens
auf chromosomaler Ebene ist in der Regel nur durch Verwendung natürlicher Aktivator- oder Repressor-Mechanismen, etwa auf der Ebene der Transkriptionsfaktoren und miRNAs, möglich. Ein Gene-Knockdown kann auf transientem Weg durch posttranskriptionelle Silencing-Mechanismen unter Verwendung entsprechender Moleküle, wie beispielsweise siRNA oder Antisense-RNA  vermittelt werden. Die Regulation der Promotoraktivität durch DNA-bindende Aktivatoren ist bisher auf einige wenige definierte Systeme zur Expressionskontrolle beschränkt. In diesen Systemen kommen natürliche Regulationsprozesse zur Anwendung, wie etwa das Lac-Operon oder Tet-Repressormoleküle. Die Anwendung solcher induzierbaren Systeme beschränkt sich in der Regel auf die Expression heterologer Proteine für biotechnologische Zwecke. Eine echte Regulation der endogenen Genexpression ist aufwendig. Posttranskriptionelle Methoden, welche die mRNA zum Ziel haben, können zwar die Expression des Zielgens herunterregulieren, aber eine Erhöhung der Expression lässt sich auf diesem Weg nicht erreichen. TAL-Effektoren können durch die frei wählbare Zielsequenz beliebige Regionen im Chromosom anvisieren und in Verbindung mit einer Aktivator- oder Repressoreinheit spezifisch die Genexpression steuern. Die Bindung einer TAL-Bindedomäne an Promotorsequenzen führt bereits zu einer Repression der Promotoraktivität.

Neue Anwendungsfelder

Ein großer Vorteil der TAL-Effektoren ist ihre enorme Flexibilität bezüglich der Wahl der Zielsequenz und der Anwendungsvielfalt. TAL-Effektoren können beliebige funktionelle Einheiten spezifisch zu einer genau definierten DNA-Zielsequenz dirigieren. Die DNA-Zielsequenzen unterliegen minimalen Restriktionen, so muss die Zielsequenz im Moment noch mit einem Thymidin beginnen. Die Länge der Zielsequenz ist ebenfalls sehr variabel, ein Bereich von 10 bis 25 Nukleoiden hat sich aber als praktikabel herauskristallisiert. Die Entschlüsselung des Bindungscodes bietet weitere Variationsmöglichkeiten und Spielräume, um die Spezifität und Bindungseffizienz zu modulieren. Die kompakte räumliche Struktur der TAL-DNA-Bindedomäne, mit den zentralen variablen Repeat-Einheiten und dem flankierenden konservierten Proteingerüst, erlaubt die Fusion mit anderen Protein-Domänen (oder Nicht-Protein-Anteilen), ohne die Bindeeigenschaften zu beeinflussen. Dies erlaubt das Bestücken der DNA-Bindeeinheit mit einer beliebigen Funktion. Die Fusionsanteile kodieren in der Regel eine enzymatische Funktion, können aber auch andere Eigenschaften wie etwa signalgebende (Fluoreszenz, FRET) oder strukturell verbindende Funktionen (Dimerisierung analog zum Yeast Two-Hybrid System, oder zum Cross-Linking) vermitteln. Entsprechend dieser Möglichkeiten ist die Bandbreite potentieller Anwendungsgebiete groß. Momentan werden TAL-Effektoren überwiegend mit Nuklease-, Aktivator- und Repressorfunktion eingesetzt (Abb. 2). Die Nukleasefunktionen bieten bereits verschiedene Einsatzmöglichkeiten im Bereich des Genome Editing und -Engineering, und Aktivator- und Repressorfunktionen wurden ebenfalls erfolgreich eingesetzt. Anwendungen in der Epigenetik zur Modulation der Chromosomenstruktur sind bereits in der Erprobung. Die enorme Vielfalt der möglichen Anwendungen wird sehr schnell zu neuen Einsatzbereichen führen, die zum Teil jetzt noch nicht absehbar sind. Zu dieser Entwicklung werden die schnelle Verfügbarkeit und die geringen Kosten wesentlich beitragen. 

Literatur

[1] Jens Boch, Heidi Scholze, Sebastian Schornack , Angelika Landgraf, Simone Hahn, Sabine Kay, Thomas Lahaye, Anja Nickstadt, Ulla Bonas. “. Science. 2009 Dec 11;326(5959):1509-12

Korrespondenzadresse

Frank Notka
frank.notka[at]lifetech.com

 

GeneArt® Precision TALs sind nur für Forschungszwecke und nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke in Bezug auf Menschen oder Tiere bestimmt.

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Heft 3/2012

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http://www.laborwelt.de/spezialthemen/funktionsgenomik/targeting-mit-tal-tools.html

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