Thema:

Affinomics

Antikörper zur Funktions-Analyse des Proteoms

Die Personalisierte Medizin steckt noch in den Kinderschuhen. Zurzeit zielt sie mehr auf eine Patientenstratifizierung, um aus einem begrenzten Portfolio an vorhandenen Therapie-Optionen die am besten passende auszuwählen, anstatt eine speziell auf die Person abgestimmte Therapie zu ermöglichen. Für letzteres ist die Translation von Information auf der Ebene von DNA/RNA nur bedingt geeignet, da therapeutische Ansätze im allgemeinen Proteine beeinflussen, die für die meisten zellulären Aktivitäten verantwortlich sind. Folglich muss einer globalen Analyse des persönlichen Erbguts einer Person eine globale Analyse aller Proteine folgen. Als eines der ersten Projekte dieser Art zielt die europäische Affinomics-Initiative darauf ab, die für dieses Ziel nötigen Reagenzien und Methoden zu entwickeln und zu standardisieren.

Für die möglichst vollständige Bestimmung des Proteoms sind sowohl für die diagnostische Analyse als auch zusätzlich für den Einsatz als mögliche therapeutische Reagenzien eine Vielzahl optimierter Antikörper oder anderer, äquivalenter Bindemoleküle notwendig. Als eines der ersten Projekte dieser Art will die europäische Affinomics-Initiative neben einer größeren Zahl an bindenden Molekülen ebenso die Grundlage für die Herstellung und Charakterisierung solcher Affinitätsreagenzien im großen Rahmen schaffen und die Kommunikation der gewonnenen Information standardisieren.

In den vergangenen zehn Jahren hat sich das Gebiet der molekularen Medizin enorm weiterentwickelt. Dies liegt im Besonderen an der Möglichkeit, die menschliche Erbsubstanz – das Genom – vollständig zu entziffern. Die Technologie hat sich so weit entwickelt, dass eine Untersuchung des gesamten Genoms jedes einzelnen Patienten für eine Reihe von Krankheiten, insbesondere genetisch bedingte Erkrankungen wie etwa Krebs, in wenigen Jahren zur Routine gehören wird. Trotz dieses unglaublichen Fortschritts im Erfassen krankheitsrelevanter Veränderungen der DNA und RNA ist die Möglichkeit einer Translation dieser Information in klinische Therapieansätze begrenzt. Ein Grund dafür ist, dass Therapeutika im allgemeinen Pro-teine beeinflussen; zurzeit zielen etwa 97% aller zugelassenen Wirkstoffe auf Proteine. 

Bereits die überraschend geringe Zahl an Genen deutet an, dass viele zelluläre Aktivitäten nicht auf der Ebene der Nukleinsäuren reguliert werden, obwohl die noch junge Erkenntnis, dass es viele nicht-kodierende RNA-Moleküle mit wichtigen regulativen Funktionen geben kann, das Gewicht wieder in Richtung der Nukleinsäuren verschoben hat. In jedem Fall sind Proteine an quasi allen zellulären Prozessen beteiligt und werden in ihrer Struktur und damit häufig in ihrer Aktivität verändert. Das Ausmaß und die Wichtigkeit von Proteinmodifikationen werden durch die Tatsache dokumentiert, dass 5% bis 10% aller menschlichen Gene für Proteine kodieren, die andere Proteine modifizieren. 

Im Gegensatz zum Erkenntnisstand über Nukleinsäuren ist global betrachtet das Verständnis der Proteinebene zurzeit noch relativ unvollständig und ungenau. Aufgrund der offensichtlich zentralen Rolle von Proteinen und den Möglichkeiten, die sich dank neuer Methoden ergeben, hat sich die Intensität von Analysen des vollständigen Proteingehalts – des Proteoms – einer Zelle oder eines Gewebes in den letzten Jahren wesentlich erhöht. Das Proteom ist wesentlich komplexer hinsichtlich der Strukturen und biophysikalischen Eigenschaften der Moleküle als das Genom, das sich grundsätzlich aus Molekülen gleicher Struktur und sehr ähnlicher Biochemie zusammensetzt. Allein die Zahl der Bausteine, 20 Aminosäuren für Proteine anstelle von jeweils vier Nukleotiden bei RNA und DNA, dokumentiert diesen Unterschied. Außerdem unterliegt das Proteom kontinuierlich dynamischen Veränderungen. Deshalb sind die Herausforderungen bei einer globalen und gleichzeitig quantitativen Analyse des Proteoms wesentlich größer und vielschichtiger als bei Genomanalysen.

Für eine grundlegende Untersuchung des Proteoms ist die Verfügbarkeit von Antikörpern – oder anderen, entsprechenden Bindemolekülen – für jedes einzelne Protein unabdingbar. Es gibt momentan etwa 130.000 Antikörper von kommerziellen Anbietern, wobei für viele Proteine ein redundantes Angebot besteht, während es für andere keinerlei Antikörper gibt. Trotz dieses scheinbar großen Angebots, sind wir immer noch weit von einem vollständigen Satz an zuverlässigen und gut charakterisierten Bindern hoher Spezifität und Affinität entfernt. Selbst unter der Annahme, dass pro Gen nur ein Genprodukt, sprich Protein, entsteht, fehlen viele Antikörper. Dazu kommt die Vielzahl an unterschiedlichen Proteinmodifikationen, die erkannt werden müssen. Dies reicht von Splice-Varianten bis zu posttranslationalen Modifikationen, wie etwa Phosphorylierungen oder Ubiquitinierungen. Eine genaue Analyse von Unterschieden in der Protein-Glykosylierung ist augenblicklich noch jenseits der bestehenden Möglichkeiten. Zusätzlich sind für viele Anwendungen unterschiedliche Affinitätsmoleküle notwendig; ein Nachweis eines Proteins innerhalb einer Zelle erfordert andere Moleküle als eine Immunfällung oder der Nachweis von Proteinen in Gewebeschnitten.

Weltweit wurden vor kurzem erste koordinierte Programme aufgelegt, um Affinitätsreagenzien in unterschiedlichen Formaten als globale Ressource bereitzustellen. Beispiele dafür sind ProteomeBinders (www.proteomebinders.org), Affinomics (www.affinomics.org), die Clinical Proteomic Technologies Initiative (proteomics.cancer.gov) oder die Antibody Factory (www.antibody-factory.de). Der Human Proteome Atlas (www.proteinatlas.org) ist im Augenblick am weitesten fortgeschritten und dürfte in einem guten Jahr für jedes der etwa 22.000 menschlichen Gene einen polyklonalen Antikörper gegen das vorhergesagte Genprodukt bereitgestellt und mittels der Antikörper die Lokalisation des Proteins in verschiedenen Geweben bestimmt haben. Vom Ansatz her sind alle genannten Initiativen noch relativ kleinformatig – trotz einer recht großen Zahl an Bindern, die jeweils hergestellt und charakterisiert werden. Dies liegt neben finanziellen Beschränkungen auch daran, dass als Teil der Projekte die besten Affinitätsmoleküle für die verschiedenen Anwendungen definiert werden. Gleichzeitig werden experimentelle Parameter untersucht, um die Grenzen der einzelnen Analyseformen auszureizen. Zusätzlich werden die Grundlagen geschaffen, um die Datenspeicherung und die Kommunikation der Ergebnisse zu standardisieren.

Das von der Europäischen Kommission geförderte Affinomics-Konsortium, das auf der ProteomeBinders-Initiative aufbaut, kombiniert ein ganze Reihe von Gruppen mit der Expertise, um all die oben genannten Aspekte abzudecken. Neben Produzenten der Zielproteine und von Epitopen mit unterschiedlichen Modifikationen nehmen eine ganze Reihe von Gruppen teil, die Affinitätsreagenzien produzieren. Einige der oben genannten Aktivitäten, wie der Human Proteome Atlas und die Antibody Factory, nehmen ebenfalls teil. Das Portfolio von Bindern reicht von IgG-Antikörpern aus Kaninchen und Mäusen, über Antikörpern aus Kamelen, die eine andere Struktur besitzen, rekombinanten „single chain fragment“ (scF) Bindern bis zu Darpins, niedermolekularen Bindemolekülen, deren Spezifität gezielt konstruiert werden kann. Dazu kommen Aptamere – Oligonukleotide, die spezifisch an ein Epitop binden. Außer der Charakterisierung der gewonnenen Bindemoleküle wird in dem Konsortium ihre Eignung für eine Reihe von Anwendungen untersucht. Ein Schwerpunkt dabei sind Microarray-basierte Studien. Diese haben mittlerweile eine Qualität erreicht, die jene übertrifft, die für eine klinische Zulassung von DNA-Microarrays Voraussetzung ist Gleichzeitig ist eine Sensitivität bis zum Nachweis von Interaktionen einzelner Moleküle selbst ohne Signalamplifikation möglich. Daneben bilden Aspekte der Datenspeicherung und Datenkommunikation einen weiteren Schwerpunkt.

Ausblick

Während ein erster Satz von 22.000 Antikörpern gegen das grundlegende menschliche Proteom in wenigen Monaten existieren wird, wird es einige Jahre dauern, um ein breites Portfolio an Bindern zu produzieren, die gegen die geschätzten ein bis zwei Millionen Protein-Isoformen sowie für alle relevanten Anwendungen in unbegrenzten Mengen verfügbar sein werden. Aufbauend auf den Erfahrungen von Aktivitäten wie Affinomics wird dieses Ziel jedoch recht schnell erreichbar sein. Bereits auf dem Weg zu diesem Ziel werden wichtige Ergebnisse gewonnen werden, die eine unmittelbare Anwendbarkeit ermöglichen. So kann beispielsweise der Zugang zu menschlichen Genomsequenzen für aberzehntausende von Individuen die Grundlage für eine gezielte affinitätsbasierte Untersuchung von Proteinen bilden. Krankheitsrelevante Protein-Isoformen, die auf Basenaustauschen, Sequenz-Deletionen oder Splice-Varianten basieren, können mit passenden Affinitätsreagenzien gezielt auf ihre Struktur und Funktionaltät analysiert und mit den „gesunden“ Isoformen verglichen werden. Dies kann die Grundlage für neue, gezielte und vor allem Individuum-spezifische Therapien bilden.

Literatur

[1] Taussig et al. (2007). ProteomeBinders: planning a European resource of affinity reagents for analysis of the human proteome. Nature Meth. 4, 13-17.
[2] Alhamdani, M.S.S., Schröder, C. & Hoheisel, J.D. (2009). Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Medicine 1, 68
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[4] Mustafa, S.A., Hoheisel, J.D. & Alhamdani, M.S.S. (2011). Secretome profiling with antibody microarrays. Mol. Biosyst. 7, 1795-1801.
[5] Alhamdani et al. (2012). Immunoassay-based proteome profiling of 24 pancreatic cancer cell lines. J. Proteomics 75, 3747-3759.

Korrespondenzandresse

Jörg D. Hoheisel
Funktionelle Genomanalyse
Deutsches Krebsforschungszentrum
Im Neuenheimer Feld 580
69120 Heidelberg

Tel.: +49-(0)6221-42-4680
Fax: +49-(0)6221-42-4682
j.hoheisel[at]dkfz.de
www.dkfz.de/funct_genome/

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