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Einblick in das humane Sekretom

Erstmals ist es gelungen, einen Großteil der Proteine zu identifizieren, die in humanen Zellen an der Sekretion beteiligt sind, also dem Ausschleusen von Stoffen aus der Zelle. Um das humane Sekretom zu erfassen, schalteten die Forscher um Rainer Pepperkok vom EMBL in Heidelberg und Kollegen vom University College Dublin in HeLa-Zellen jedes der rund 22.000 menschlichen Protein-codierenden Gene mittels RNA-Interferenz (RNAi) aus und beobachteten mit Hochdurch-satzmikroskopie wie stark der Knock-down die Sekretion eines fluoreszenzmarkierten Proteins beeinträchtigte. Das Ergebnis: Mindestens 545 Proteine sind an der Sekretion beteiligt. 

Für die Studie wurden mehr als 8 Millionen Zellen und 700.000 Mikroskopiebildern ausgewertet. Von den 545 Proteinen scheinen 143 wichtig für frühe Prozesse, die im Endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat stattfinden, 59 sind Bestandteil der bereits bekannten Sekretionsmaschinerie. Die Arbeiten ebnen den Weg zu einem Verständnis der Regulation von Sekretionsprozessen und bergen damit das Potential, pathologische Störungen der Sekretion kausal zu verstehen.

Simpson JC, Joggerst B, Laketa V, Verissimo F, Cetin C, Erfle H, Bexiga MG, Singan VR, Hériché JK, Neumann B, Mateos A, Blake J, Bechtel S, Benes V, Wiemann S, Ellenberg J, Pepperkok R (2012): Genome-wide RNAi screening identifies human proteins with a regulatory function in the early secretory pathway, Nat. Cell Biol. 2012 Jun 3;14(7):764-74. doi: 10.1038/ncb2510.

LABORWELT:
Was war die Motivation für Ihre Arbeiten und die Wahl Ihres experimentellen Systems?

Pepperkok:
Wir haben zum ersten Mal weltweit das Sekretom einer menschlichen Zelle erfasst. Wir haben dazu HeLa-Zellen gewählt, weil sie technisch einfach zu untersuchen sind. HeLa-Zellen bewegen sich auf den von uns dazu eingesetzten siRNA-Arrays nicht sehr stark; das ist ein Grund, weshalb wir mit ihnen arbeiten. Zweitens, wir haben 2010 vergleichbare Studien mit HeLa-Zellen veröffentlicht, wo wir einen genomweiten siRNA-Screen der Mitose gemacht haben. Die Daten der damaligen und aktuellen Arbeit lassen sich sehr gut miteinander vergleichen. Um grundlegende Mechanismen des sekretorischen Weges zu analysieren, halten wir HeLa-Zellen zudem für hinreichend informativ. Das ist natürlich anders, wenn es um einen krankheits- oder gewebespezifischen Kontext geht. Da muss man entsprechend andere Zellen wählen.

LABORWELT:
Wie sind Sie methodisch vorgegangen, um das Sekretom zu analysieren?

Pepperkok:
Unser Ziel ist es, die an der Regulation der sekretorischen Pathways beteiligten Moleküle als Gesamtsystem zu verstehen. Wir mussten dazu verschiedene Methoden etablieren. Vor fast 10 Jahren haben wir mit Stefan Wiemann begonnen, Proteine mit GFP zu taggen, zu lokalisieren und zu sehen, ob sie in der Sekretion eine Rolle spielen könnten. Wir haben diese exprimiert, um dann funktionell den Einfluss der Überexpression zu sehen. Bereits damals haben wir Hochdurchsatz-Mikroskope entwickelt, die es uns erlauben, im Hochdurchsatz funktionelle zellbasierte Assays anzuschauen und zu quantifizieren. Diesen Ansatz haben wir im Laufe der Jahre weiter verfeinert. Wir mussten in diesem großen Durchsatz Zellen mit siRNAs transfizieren. Dazu haben wir eine Methode zur reversen Transfektion von Array-gebundenen Zellen entwickelt. Nach Erstellen einer siRNA-Bibliothek in Kooperation mit Ambion, deren siRNAs jeweils tatsächlich nur die Expression eines Transkripts hemmen, und Entwicklung verschiedener Methoden der automatischen Bildanalyse waren wir soweit, das humane Sekretom erstmals zu analysieren.

LABORWELT:
Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse?

Pepperkok:
Es ist ein immenser technischer Fortschritt, dass wir die Stärke morphologischer Veränderungen der Zelle im Hochdurchsatz erfassen können. Wissenschaftlich gesehen, gab es gleichermaßen erfreuliche wie auch enttäuschende Ergebnisse. Wir haben gelernt, dass Schlüsselproteine zum Teil nicht mit dieser Methode identifiziert werden können. Ein Grund ist, dass sie redundant exprimiert werden, das heißt, ähnliche Proteine übernehmen die Funktion des stillgelegten Proteins. Das scheint für Schlüsselproteine im sekretorischen Weg ein generelles Prinzip zu sein. Was wir aber gesehen haben und sehen wollten, sind Proteine die die Sekretion regulieren, zum Beispiel signalübertragende Proteine, wie den EGF-Rezeptor; wir haben 170 Transkriptionsfaktoren identifiziert, deren Rolle beim Membrantransport noch gar nicht erforscht ist. Unterdessen haben wir Muster gefunden, die darauf heinweisen, dass eine Housekeeping-Aktivität der Sekretion von verschiedenen Gruppen von Transkriptionsfaktoren reguliert wird.

LABORWELT:
Wie lassen sich die funktionell redundanten Schlüsselproteine weiter analysieren?

Pepperkok:
Wir können die funktionelle Redundanz ausnutzen, indem wir das Schlüsselprotein und das funktionell dazu komplementäre Protein gleichzeitig ausschalten. Wenn wir das tun, sehen wir einen ganz drastischen Effekt auf die Sekretion. Das ermöglicht die Analyse ganzer Proteinnetzwerke. Im Falle der Sekretion konnten wir so aufklären, wie Cytoskelett­elemente mit dem vesikulärem Coat-Protein interagieren.

LABORWELT:
Wo liegt das Anwendungspotential Ihrer Ergebnisse?

Pepperkok:
Mit derselben Technologie lassen sich auch krankheitsrelevante Protein-Protein-Wechselwirkungen untersuchen. Wir haben mit Kollegen bereits gegonnen, die Wechselwirkungen beim Proteintrafficking der Zystischen Fibrose zu erfassen.

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Heft 3/2012

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http://www.laborwelt.de/spezialthemen/funktionsgenomik/human-sekretom.html

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