Thema:

Biosensorik

Chip-basierte Sensoren für die Biotechnik

Am Institut für Nano- und Biotechnologien (INB) der Fachhochschule Aachen wird seit mehreren Jahren an Chip-basierten Sensoren zur Erfassung chemischer und biologischer Größen geforscht. Zur Herstellung dieser Sensoren wird dabei auf bewährte Verfahren der Siliziumplanartechnologie zurückgegriffen. Beispielhaft werden in diesem Artikel kapazitive Feldeffektsensoren zur pH-Messung und enzymbasierte Biosensoren zum Nachweis von Glukose, Glutamat und Glutamin vorgestellt.

Die Herstellung von pharmazeutischen Produkten erfolgt heutzutage nicht mehr nur durch chemische Synthese, sondern auch biotechnologisch mit Hilfe lebender Zellen. Biotechnologische Prozesse sind in der Regel hochkomplex. Die verwendeten Zellen und Mikroorganismen müssen unter optimalen und definierten Bedingungen im Bioreaktor kultiviert werden, um reproduzierbar Produkte hoher Qualität erzeugen zu können. Analytische Verfahren spielen somit eine zentrale Rolle bei dem Verständnis und der Optimierung dieser Prozesse1. Während der Kultivierung werden Substrate verbraucht und Produkte sowie Metabolite erzeugt. Diese Änderungen haben direkten Einfluss auf die Umgebungsbedingungen im Bioreaktor. Zur Beschreibung dieser Bedingungen werden neben physikalischen Parametern (z.B. Temperatur, Druck) sowohl chemische (z.B. pH-Wert, Nährstoffkonzentration) als auch biologische (z.B. Zellaktivität) Parameter erfasst2. Aufgrund der möglichen Integration mehrerer Funktionalitäten innerhalb eines Bauelementes könnten hierbei Chip-basierte Sensoren als Analysetool Einsatz finden. 

Kapazitiver pH-Sensor

Potentiometrische pH-Einstab-Glaselektroden ermöglichen in der Bioverfahrenstechnik zwar einerseits eine permanente Überwachung des pH-Wertes, andererseits stellen deren unzureichende Autoklavierbarkeit und Handhabung im praktischen Einsatz limitierende Faktoren dar. Solche pH-Elektroden müssen für einen sterilen Messbetrieb autoklavierbar sein, was sowohl eine verringerte Lebensdauer als auch Abweichungen in der Messcharakteristik (Kalibrierungsfehler) zur Folge haben kann und häufig ein Austauschen der Elektroden notwendig macht. Während des Messeinsatzes kommt es zudem häufig zu Verschmutzungen oder Verstopfungen des Diaphragmas durch Bestandteile des Mediums (z.B. durch Proteine), was zu Messungenauigkeiten führen kann. Daneben stellt vor allen Dingen Glasbruch bei unsachgemäßem Ein- und Ausbau eine weitere Hauptausfallursache dar. 

Neue Alternativkonzepte auf der Basis von Feldeffektstrukturen wie etwa Ionen-sensitive Feldeffekttransistoren (ISFETs) scheitern bisher im Wesentlichen an einer unzureichenden Langzeitstabilität und Zuverlässigkeit im Messbetrieb sowie an den relativ hohen Herstellungskosten. Verglichen mit ISFETs bestechen planare EIS (Elektrolyt-Isolator-Silizium)-Strukturen (d.h. nicht photolithographisch strukturierte Feldeffektsensoren) durch ihre einfachere Herstellung und vielfältige Nutzbarkeit3

Derartige kapazitive EIS-Sensoren bestehen aus einem halbleitenden Siliziumsubstrat, auf dem durch thermische Trockenoxidation eine etwa 30 nm dünne Siliziumdioxidschicht (SiO2) aufgewachsen wird. Zum Messbetrieb wird die Oberfläche des Sensorchips in Kontakt mit der Analytlösung gebracht. In den meisten Fällen kann der Sensorchip mit einem O-Ring gegen die Flüssigkeit abgedichtet werden, wodurch ein aufwendiger Verkapselungsprozess wie z.B. bei ISFETs hinfällig wird. Der elektrische Stromkreis wird über eine Referenzelektrode (z.B. Ag/AgCl), welche Kontakt zum Elektrolyten und ein definiertes Potential liefert, geschlossen (siehe Abb. 1a). 

In Abhängigkeit von der Protonenkonzentration des zu messenden Elektrolyten stellt sich an der Grenzfläche Elektrolyt/Isolator eine definierte Oberflächenladung ein. Diese wiederum führt zu einer Kapazitätsänderung der Sensorstruktur, welche die eigentliche Messgröße des Sensorchips darstellt. Wird nun die Kapazität der Sensorstruktur mit Hilfe eines Regelkreises konstant gehalten, so lässt sich der zeitliche Verlauf des Oberflächenpotentials direkt in Abhängigkeit vom pH-Wert bestimmen. Abbildung 1b zeigt beispielhaft das Sensorverhalten in pH-Pufferlösungen im Bereich von pH 10 bis pH 3. 

Zur Verbesserung der Sensorcharakteristika kann eine weitere Dünnschicht auf dem SiO2 abgeschieden werden. Bei der Wahl eines geeigneten pH-sensitiven Transducermaterials zeigt insbesondere eine Doppelisolatorschicht bestehend aus SiO2 und Tantalpentoxid (Ta2O5) herausragende Eigenschaften. Ta2O5 ist chemisch äußerst beständig und weist eine nahezu Nernst’sche Sensitivität auf. Mit Ta2O5-basierten pH-Sensoren wird eine Ansprechzeit (90%) von weniger als einer Minute bei einer mittleren pH-Sensitivität von 57 mV/pH und einer Messgenauigkeit von 0,1 pH im Bereich von pH 2 bis pH 12 erzielt. Die Robustheit von Ta2O5 ermöglicht den Einsatz solcher Sensoren auch in (biologischen) Produktionsanlagen, die mittels Cleaning-in-place (CIP)- oder Sterilisation-in-place (SIP)-Verfahren gereinigt werden müssen. Auch nach bis zu 30 CIP- bzw. SIP-Zyklen konnte kein Nachlassen der pH-Sensitivität festgestellt werden3,5. Des Weiteren konnte der Einsatz eines EIS-Sensors zum inline-Monitoring des pH-Wertes während einer Zellkulturfermentation erfolgreich demonstriert werden3,6.

Mikrofluidikchip mit enzymbasierten Biosensoren

Ein weiteres Anwendungsbeispiel, bei dem Chip-basierte Sensorsysteme eine Rolle spielen können, stellt die Erfassung von relevanten Nährstoffkonzentrationen bei Fermentationsprozessen dar. Am INB wurde als möglicher Lösungsansatz unlängst ein Mikrofluidikchip entwickelt, der drei enzymbasierte, amperometrische Biosensoren zum Nachweis von Glukose, Glutamat und Glutamin auf einem einzigen Chip integriert7.

Die Herstellung des Mikrofluidikchips erfolgte in drei Schritten: Zunächst wurden Platindünnschichtstrukturen mittels Elektronenstrahlverdampfung abgeschieden und mit Lift-off-Technik strukturiert. Anschließend wurde ein linearer Fluidikkanal auf dem Chip durch photolithographische Strukturierung eines 100 µm dicken SU-8 Photolacks erzielt. Die Breite des Kanals beträgt 1,75 mm und der Abstand zwischen Einlass und Auslass 15 mm. Die Funktionalität der Biosensoren wurde durch Immobilisierung unterschiedlicher Enzyme gewährleistet, die spezifisch die Nährstoffkonzentration im Analyten detektieren. Zur Herstellung des Glukosesensors wurde hierzu auf Glukose-Oxidase zurückgegriffen, der Glutamatsensor basierte auf Glutamat-Oxidase. Die Detektion von Glutamin erfolgte durch Kopplung zweier Enzyme: Glutaminase katalysiert die Umsetzung von Glutamin zu Glutamat, welches anschließend von Glutamat-Oxidase umgesetzt wird. Bei den Oxidase-basierten Reaktionen entsteht als Nebenprodukt der enzymatischen Reaktion Wasserstoffperoxid. Dieses wird an den gegen eine Ag/AgCl-Referenzelektrode polarisierten Platinelektroden umgesetzt. Der resultierende Strom fungiert als Maß für die Analytkonzentration8

In Abbildung 2a ist ein derartiger Mikrofluidikchip mit immobilisierten Enzymmembranen dargestellt. Zur Messung wurde der Fluidikkanal mit einem Plexiglasdeckel verschlossen und an ein Fließinjektionsanalyse-System angeschlossen. Die Biosensoren wurden systematisch hinsichtlich ihrer intrinsischen Sensoreigenschaften (Sensitivität, linearer Messbereich, untere und obere Nachweisgrenzen) charakterisiert. Abbildung 2b zeigt exemplarisch das Ansprechverhalten des Glutaminsensors auf eine dreifache Injektion von Analytlösung mit einer Glutaminkonzentration im Bereich von 0,01 mM bis 20 mM. Die ermittelten Sensitivitäten beliefen sich auf 1,47, 3,68 und 0,28 µAs/mM für den Glukose-, den Glutamat- bzw. den Glutaminsensor. Im Falle des Glukose- und des Glutamatsensors wurde eine untere Nachweisgrenze von 0,05 mM ermittelt, für den Glutaminsensor betrug diese 0,1 mM. Die Kennlinien des Glukose- und des Glutaminsensors verliefen linear bis zu einer Analytkonzentration von 20 mM, die des Glutamatsensors bis zu 10 mM.

Die Verwendung der bi-enzymatischen Nachweisreaktion für den Glutaminsensor hat zur Folge, dass dieser einer intrinsischen Querempfindlichkeit gegenüber Glutamat unterliegt. Das bedeutet, der Glutaminsensor ist nicht allein in der Lage, zwischen Glutamat und Glutamin in der Messprobe zu unterscheiden. Dennoch konnte durch die zusätzliche Integration des Glutamatsensors eine Differenzanordnung realisiert werden, welche die Querempfindlichkeit signifikant reduziert7. Das dargestellte Sensorprinzip lässt sich durch Modifizierung der Rezeptorschicht beispielsweise durch Immobilisierung von weiteren Enzymen oder Ionen-selektiven Membranen erweitern.

 

Die Autoren danken S. Beging, A. Poghossian und T. Wagner für die technische Unterstützung und fachliche Diskussion.

 

Literatur 

[1] Ulber, R., Hitzmann, B., Scheper, T., Chemie Ingenieur Technik 73 (2001), 19-26.

[2] Rehbock, C., Beutel, S. Brückerhoff, T., Hitzmann, B., Riechers, D., Rudolph, G., Stahl, F., Scheper, T., Friehs, K., Chemie Ingenieur Technik 80 (2008), 267-286.

[3] Schöning, M.J., Brinkmann, D., Rolka, D., Demuth, C., Poghossian, A., Sensors and Actuators B 111-112 (2005), 423-429.

[4] Wagner, T., Maris, R.J., Ackermann, H.-J., Otto, R., Beging, S., Poghossian, A., Schöning, M.J., Sensors and Actuators B 127 (2007), 217-223.

[5] Bäcker, M., Beging, S., Biselli, M., Poghossian, A., Wang, J., Zang, W., Wagner, P., Schöning, M.J., Electrochimica Acta 54 (2009), 6107-6112. 

[6] Bäcker, M., Pouyeshman, S., Schnitzler, Th., Poghossian, A., Wagner, P., Biselli, M., Schöning, M.J., Physica Status Solidi A 208 (2011), 1364-1369.

[7] Bäcker, M., Rakowski, D., Poghossian, A., Biselli, M., Wagner, P., Schöning, M.J., Journal of Biotechnology (2012) 10.1016/j.jbiotec.2012.03.014.

[8] Bäcker, M. Delle, L., Poghossian, A., Biselli, M., Zang, W., Wagner, P., Schöning, M.J., Electrochimica Acta 56 (2011), 9673-9678.

 

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Michael J. Schöning
Fachhochschule Aachen, Campus Jülich
Institut für Nano- und Biotechnologien
Heinrich-Mußmann-Str. 1
52428 Jülich

Tel.: +49-(0)241-6009-53215
Fax: +49-(0)241-6009-53235
www.fh-aachen.de/inb.html
E-Mail: Schoening[at]fh-aachen.de

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