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Optimierung von Mixed-feeding-Strategien

Feeding-Strategien mit verschiedenen Substraten werden oft untersucht, um die Produktivität der Expression rekombinanter Proteine in Pichia pastoris zu verbessern. Normalerweise erfolgt die Optimierung des Substratmischungsverhältnisses oder der Methanolkonzentration empirisch auf Basis zahlreicher Fed-batch-Experimente oder zeitaufwendiger kontinuierlicher Prozesse. In einer aktuellen Studie haben Wiener Wissenschaftler um Oliver Spadiut die Substratversorgung mit Methanol und Glycerin einem Fed-batch-Prozess entkoppelt und den Einfluss der Substrataufnahmerate qs auf Substratflux und Expression des Modellproteins Merrettich-Peroxidase in einer P.  pastoris-Mutante untersucht. Mit dieser Strategie konnten Spadiut und Kollegen die spezifische Glyzerin-Aufnahmerate bestimmen, bei der die Produktivität nachließ. 

Dénes Zalai, Christian Dietzsch, Christoph Herwig,Oliver Spadiut; A dynamic fed batch strategy for a Pichia pastoris mixed feed system to increase process understanding; Biotechnol Prog. 2012 Apr 14. doi: 10.1002/btpr.1551

LABORWELT:
Was ist der Hintergrund Ihrer Arbeiten?

Spadiut:
Im Rahmen der Quality-by-Design (QbD)-Initiative fordert die FDA vor allem pharmazeutische Betriebe zu erhöhtem Prozessverständnis und wissenschaftlich basierter Prozesskontrolle auf, um auf dieser Basis gesicherte Produktqualität und -quantität zu erzielen. Viele pharmazeutisch relevante Proteine werden momentan rekombinant, also mittels gentechnisch veränderter Mikroorganismen, hergestellt. Ein wichtiger Organismus hierfür ist die Hefe Pichia pastoris. Eines der Ziele unserer Arbeit ist es, basierend auf QbD-Prinzipien innovative und effektive Bioprozesse mit diesem Mikroorganismus zu entwickeln und aufgezeichnete Daten und erhaltene Informationen in Wissen umzuwandeln, um das generelle Prozessverständnis zu erhöhen und wissenschaftlich basierte Bioprozesse generieren zu können.

LABORWELT:
Wie sind Sie methodisch vorgegangen?

Spadiut:
Zur Ertragssteigerung der methylotrophen Hefe P. pastoris und zur Verringerung von im Prozess produzierter Wärme und benötigtem Sauerstoff werden oft sogenannte „mixed-feed“-Strategien verwendet, das heißt, die Mikroorgansimen werden mit einer Mischung aus Glyzerin und Methanol gefüttert. Da Glyzerin in gewissen Konzentrationen jedoch die Expression rekombinanter Proteine reprimiert, musste man das optimale Verhältnis dieser zwei Substrate bis dato in recht aufwendigen Experimenten bestimmen. In dieser Arbeit kontrollierten und variierten wir die „spezifische Substrataufnahmerate (qs)“ von Glyzerin und Methanol separat und konnten in nur wenigen Experimenten gewisse Effekte der einzelnen Substrate sowohl auf den Metabolismus der Hefe als auch auf die rekombinante Proteinexpression zeigen.

LABORWELT:
Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse?

Spadiut:
Durch dynamische Fed-Batch-Experimente konnten wir die spezifische Aufnahmerate von Glyzerin, bei der die maximale spezifische Produktivität eines rekombinanten Enzyms erzielt werden konnte und bei deren Überschreitung reprimierende Effekte hervorgerufen wurden, relativ einfach und innerhalb kurzer Zeit bestimmen. Außerdem konnten wir den Vorteil einer dynamischen Prozessführung gegenüber konventionellen Methoden zeigen und identifizierten einen zeitabhängigen Effekt der Produktivität von P. pastoris. Diese Arbeit zeigt die Vorteile und den Nutzen der spezifischen Substrataufnahmerate qs als Parameter für Bioprozesskontrolle und -optimierung in einem mixed-feed-System und unterstreicht die Bedeutung von dynamischen Experimenten in der Bioprozessentwicklung.

LABORWELT:
Welcher direkte praktische Nutzen lässt sich aus Ihrer Arbeit ziehen?

Spadiut:
Unsere innovative, auf der spezifischen Substrataufnahmerate basierende Strategie, die dynamische Batch- und Fed-Batch-Kultivierungen umfasst, ermöglicht eine schnelle und einfache Charakterisierung rekombinanter Hefestämme, erlaubt wissenschaftlich basiertes Prozessverständnis und führt außerdem zu erhöhten spezifischen Produktivitäten. Alle diese Elemente stehen im Einklang mit den QbD-Leitlinien, weshalb man die von uns entwickelte dynamische Prozessführung basierend auf qs als wertvolle Erweiterung der bioprozesstechnologischen Toolbox betrachten kann.

LABORWELT:
Wie gehen Ihre Arbeiten nun weiter?

Spadiut:
Wir arbeiten gerade an der Entwicklung und Implementierung von Konzepten und Tools, wie Soft-Sensoren, um diese dynamischen Feeding-Regime online kontrollieren und steuern zu können. Außerdem überprüfen wir, ob unsere Strategie eine generische Methode darstellt, also ob wir sie auch auf andere rekombinante Produkte, verschiedene Hefestämme und sogar andere Mikroorganismen (z.B. E. coli) anwenden können.

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Heft 2/2012

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http://www.laborwelt.de/spezialthemen/fermenter-prozesse/mixed-feeding.html

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