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GMP-gerechte Kultur von mesenchymalen Stammzellen

Die GMP-gerechte Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen sowie die Erfüllung der umfassenden europäischen und nationalen arzneimittelrechtlichen Vorgaben sind die Grundvoraussetzung für eine klinische Prüfung und Zulassung entsprechender Zellpräparate für den Einsatz am Menschen. Hierzu gilt es, einen entsprechenden Prozess zu entwickeln und kontinuierlich im Rahmen des Qualitätsmanagements zu verbessern, wie es seit langem für die Herstellung und das „in den Verkehr bringen“ von nicht zellbasierten Therapien üblich ist. Nur so können die Sicherheit und der Nutzen einer neuen Therapieform auf der Basis von mesenchymalen Stammzellen für den Patienten weitestgehend garantiert werden. In gleicher Weise erlaubt ein entsprechendes Herstellungs- und Kultivierungsverfahren die Vergleichbarkeit verschiedenster MSC-Präparate im Hinblick auf eine wissenschaftliche und (prä)klinische Bewertung von mesenchymalen Stammzellen. 

Während hämatopoetische Stammzellen (HSCs) schon seit Jahrzehnten in der klinischen Behandlung von Leukämien oder anderen bösartigen Erkrankungen eingesetzt werden, haben em-bryonale Stammzellen (ES-Zellen) oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) aufgrund ethischer Bedenken beziehungsweise noch unbekannter genetischer Risiken wohl zu Recht noch keinen unmittelbaren Einzug in die klinische Anwendung gefunden. Demgegenüber haben mesenchymale Stamm- oder Stromazellen (MSCs) in den vergangenen Jahren zunehmende Bedeutung in der möglichen Behandlung verschiedenster Erkrankungen erlangt. Dies zeigt sich nicht zuletzt in einer stark ansteigenden Zahl an wissenschaftlichen Publikationen und klinischen Prüfungen (www.clinicaltrials.gov)1-2

MSCs sind adulte Stammzellen (Abb. 1), die sich zu therapeutischen und möglicherweise auch diagnostischen Zwecken aus fast allen humanen Gewebearten leicht isolieren lassen. Humanes Knochenmark (Abb. 1D), Fettgewebe oder Nabelschnurgewebe sind gängige Entnahmequellen; die Gewinnung und Kultivierung von MSCs sind daher im Gegensatz zu ES weitgehend unumstritten. Nach aktuellem Wissensstand birgt die klinische Anwendung von MSCs am Menschen zudem wahrscheinlich weniger Sicherheitsrisiken als die Anwendung von ES und iPS1,2.

Die umfassende Charakterisierung von MSCs und ihrer biologischen Funktion in vitro und in vivo hat gezeigt, dass ihre Wirkung in der Zelltherapie durch die Sekretion von parakrinen Faktoren vermittelt wird, die zur Geweberegeneration, einer beschleunigten Wundheilung und zur Immunmodulation führt. Im Gegensatz dazu wird in der Zellersatztherapie die Fähigkeit der MSCs zur Differenzierung in ausgereifte Zellen aller Keimbahnen genutzt, zum Beispiel beim Tissue engineering1-3.

Unabhängig von der Art der Zelltherapie und der gewählten medizinischen Indikation zur klinischen Behandlung am Menschen ist die Kultivierung von MSCs immer ein sehr komplexer pharmazeutischer Prozess. Die Hauptgründe dafür liegen sowohl im hohen wissenschaftlich-medizinischen und regulatorischen Innovationsgrad sowie in den (zell)biologischen Wirkungsmechanismen im Körper, die bisher noch nicht vollständig erforscht und verstanden sind. Die zwei wichtigsten Aspekte müssen aber ohne Ausnahme bei jedem Zellpräparat erfüllt werden: 

(i) die wichtigen biologischen Eigenschaften, welche das therapeutische Potential von MSCs hegen, sollten bei ihrer Kultivierung erhalten oder sogar gefördert werden; und 

(ii) alle potentiellen Risiken für die Patienten sollten weitestgehend vorhersagbar sein und möglichst ausgeschlossen werden.

EU-Regularien

Um die Herstellung derart pharmakologisch wirksamer MSCs für die sichere klinische Anwendung am Menschen zu gewährleisten, werden kultivierte MSCs für die klinische Anwendung in Europa als sogenannte Advanced therapy medicinal products (ATMP) behandelt. Im Rahmen der ATMP-Verordnung (EC 1394/2007) hat der europäische Gesetzgeber die EG-GMP-Richtlinien (2003/94/EG) und die pharmazeutischen Standards auch bei der Kultivierung von MSCs für die klinische Anwendung durchgesetzt4,5. Das Hauptziel ist, einen umfassend sicheren, robusten und standardisierten, GMP-gerechten Produktionsprozess durch das Zusammenspiel der voneinander unabhängigen Komponenten GMP-Herstellung, GMP-Qualitätskontrolle und GMP-Qualitätssicherung sicherzustellen (Abb. 2). Dementsprechend ist seit Dezember 2011 in der pharmazeutischen Entwicklung von MSCs in Europa eine Herstellungserlaubnis in Verbindung mit einem indikationsabhängigen „Investigational Medicinal Product Dossier“ (IMPD) erforderlich4. Die nach den GMP-Richtlinien hergestellten MSCs können dann als klinisches Prüfpräparat (Annex 13, EG-GMP-Leitfaden) in einer klinischen Studie eingesetzt werden. Nach beendeter klinischer Studie kann dann die zentrale europäische Zulassung als ATMP-Arzneimittel durch die European Medicines Agency (EMA) erfolgen, da im Falle von ATMPs keine lokale Zulassung möglich ist. In bestimmten Ausnahmefällen ist auch eine Anwendung außerhalb einer klinischen Studie durch die sogenannte „Hospital exemption“ nach § 4b Abs. 3 AMG möglich6. Dies sollte jedoch auch von Seiten des Gesetzgebers nur eine Ausnahme bleiben. 

Wissenschaftlich-technische und Qualitäts-Voraussetzungen

Der GMP-Leitfaden regelt ausführlich, welche wissenschaftlich-technischen und qualitativen Voraussetzungen bei der Herstellung von MSCs als Arzneimittel gegeben sein müssen5. Die GMP-gerechte Kultivierung von MSCs findet in überwachten Reinräumen statt, die – je nach den in ihnen stattfindenden Produktionsschritten – klassifiziert sein müssen (Abb. 1 A-C). Der EG-GMP-Leitfaden sieht zum Beispiel für Durchführungen am offenen Produkt die höchste Reinheitsklasse A vor – im Gegensatz zu Produktionsschritten in geschlossenen Systemen, die in niedrigeren Reinheitsklassen C oder sogar D durchgeführt werden können. Die Reinheitsklassen sind durch Grenzwerte der in den jeweiligen klassifizierten Bereich vorkommenden Partikel und Keime definiert5,7. Die Einstufung, welche Prozessschritte in welcher Umgebung durchgeführt werden müssen, sollten durch eine Risikoanalyse des Prozesses festgelegt werden5,7. Dabei werden alle durchzuführenden Prozessschritte unter dem Aspekt betrachtet, wie hoch das Risiko einer Beeinträchtigung der Qualität der Zellkultur oder das Risiko für den Patienten ist. 

Der wesentliche Bestandteil der GMP-gerechten Kultivierung von MSCs ist eine kontinuierliche Durchführung von Qualitätskontrollen (Abb. 2). Diese beginnt bereits bei den Ausgangsmaterialien (z.B. Knochenmark), führt weiter über einen oder mehrere in-Prozess-Kontrollpunkte bis zur Qualitätskontrolle des Endproduktes und schließlich der Freigabe des Produktes für die Anwendung im Patienten durch die „Qualified Person“ (QP). Die Qualität des Produktes wird über Spezifikationen definiert, die das Endprodukt erfüllen muss. Kriterien für die Freigabe der kultivierten MSCs sind die Identität, Reinheit, Sterilität, Wirksamkeit und genetische Stabilität. Ein Problem, das sich bei der Produktion von MSCs stellt, ist, dass es bislang keinen Oberflächenmarker gibt, der für die Identitätsbestimmung von MSCs benutzt werden könnte. Nichtsdestotrotz wird weiterhin versucht, einen solchen spezifischen Marker zu identifizieren, der tatsächlich eine Bedeutung für die Funktion von MSCs besitzt. So hat sich die „International Society of Cell Therapy“ (ISCT) zunächst um einen Kompromiss aus einer Kombination von Oberflächenmarkern und 

Differenzierungspotential als Identitätskriterien für MSCs bemüht8. Ein zuverlässiges Qualitätssicherungssystem begleitet die Qualitätskontrolle sowie die Herstellung und gewährleistet, dass zu jedem Zeitpunkt der Produktion alle GMP-Standards vollständig befolgt werden (Abb.2).  

Quality-by-design

Die Wichtigkeit des Zusammenspiels von Qualitätskontrolle, Qualitätssicherung und Produktion bei der GMP-konformen Kultivierung ist besonders im pharmazeutischen Quality-by-design-Konzept ersichtlich (Abb. 2)10. Quality-by-design bedeutet, dass die Qualität ein Bestandteil des Produktes ist und daher bei der Entwicklung des Produktes und dem Herstellungsprozess berücksichtigt und in die Prozesse eingebaut werden muss. Dabei sollten kontinuierliche Risikoanalysen und das Knowledge-Management 

(i) eine weitestgehende Kontrolle über das MSC-GMP-Produkt, 

(ii) die kontinuierliche Adaptation und Verbesserung der Prozesse, und 

(iii) eine rasche Behebung aller aufgetretenen Abweichungen sowie deren künftige Vermeidung (CAPA, „corrective action and preventive action“) 

ermöglichen. Das risikobasierte Herangehen entwickelt sich mehr und mehr zu einem zentralen Bestandteil bei der Etablierung und Durchführung GMP-konformer Prozesse. Dadurch ist es möglich, schon vor und während der Entwicklung mögliche Risiken zu erkennen und zu minimieren. Die Risikoanalyse hilft weiterhin, die wesentlichen Punkte zu identifizieren, sich darauf zu konzentrieren und dadurch effizienter und schneller zu einem robusten Prozess zu gelangen10.

Für die klinische Anwendung von MSCs ist die Expansion, durch die die Charakteristik und die Qualität der Zellen möglichst nicht verändert werden, eine der wichtigsten Voraussetzungen für einen robusten Prozess. Hierbei bleibt die Diskussion weiterhin kontrovers, wie viele Zellteilungen in der Zellkultur möglich sind, ohne die biologische Funktion von MSC zu beeinflussen. Unklar ist auch, welche Bedeutung die nachgewiesenen oder vermuteten genetischen Veränderungen besitzen, die in Abhängigkeit der Passagen in der Zellkultur, der Anzahl der Zellverdopplungen und der Kultivierungsdauer auftreten können9. Entscheidend hierfür sind auch die angewendeten Methoden, z.B. WGAS („whole genome association study”) oder der Karyotyp.

Während autologe MSCs kein Risiko der Transmission von genetischem Fremdmaterial zeigen, ist die standardisierte Kultivierung auch nach GMP im Hinblick auf die Konsistenz des Prozesses zwischen einzelnen Präparaten im Gegensatz zu einem allogenen MSC-Zellproduktes zweifellos eine Herausforderung. Auch aus wirtschaftlichen Gesichtspunkten ist die Herstellung von MSCs für die autologe Anwendung durch die kleine Chargengröße, bei der ein Produktionsprozess eine Charge für einen Patienten ergibt, eine größere Herausforderung als bei der Herstellung allogener Produkte. Bei diesen können in einem Produktionsprozess eine Charge für die Behandlung vieler Patienten hergestellt werden.

 

Literatur

1. Huss, R. (2010) Stem Cells Dev. 19(5):593-4. 

2. Trounson, A. (2009) BMC Medicine 7: 29

3. Baiguera, S., et al. (2012) Transplant International 25(4): 369-82 

4. EU ATMP Verordnung: EC 1394/2007 

5. EG-GMP-Leitfaden 

6. Entscheidungsbaum: Hospital Exemption http://bit.ly/ILetVo

7. EN ISO 14644

8. Dominici, M., et al. (2006) Cytotherapy, 8(4): 315-317 

9. Sensebe, L., et al. (2011) Human Gene Therapy 22(1): 19-26

10. Yu, L.X. (2008) Pharm Res. 25(4):781-791

 

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. med. Ralf Huss
Geschäftsführung / CSO 
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