Thema:

Parallele Rührkesselreaktoren

Verbesserte Enzym-Hydrolyse von Biomassesuspensionen

Reststoffe von Pflanzen fallen täglich im Tonnenmaßstab in der Land- und Forstwirtschaft an. Diese Abfälle enthalten jedoch noch große Mengen an wertvollen Zuckermolekülen, wie Glukose und Xylose, die als Ausgangsstoffe für biotechnologische Prozesse zur Gewinnung von Chemikalien eingesetzt werden können. Neben einer stofflichen ist auch eine energetische Nutzung der erzeugten chemischen Substanzen möglich. Die dadurch gewonnenen Biokraftstoffe der zweiten und dritten Generation, wie beispielsweise Ethanol oder Butanol, stehen nicht im Wettbewerb mit der Nahrungsmittelproduktion, da ausschließlich Rest- und Abfallstoffe als Ausgangsmaterialien verwendet werden.

Für eine optimale Verwertung und biotechnologische Umsetzung dieser Pflanzenmaterialien sind zahlreiche experimentelle Untersuchungen notwendig. Eine Schlüsselrolle stellt die möglichst vollständige Freisetzung der Zuckermoleküle aus den Pflanzenmaterialien durch Enzympräparate dar. Sowohl die Entwicklung effizienter Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse als auch die Optimierung der Enzympräparate konnte durch Reihenuntersuchungen in miniaturisierten und 48-fach parallelisierten Rührreaktoren realisiert werden. Die Daten aus dem Millilitermaßstab konnten zudem direkt in den Litermaßstab übertragen werden.

Der hohe experimentelle Aufwand zur Optimierung enzymatischer Hydrolysen von Pflanzenmaterialien ist mit sequenziellen Untersuchungen im klassischen Rührkesselreaktor nur schwer zu bewältigen. Auch Reaktorsysteme mit vier bis acht parallelisierten Reaktoren sind in der Regel nicht ausreichend, um schnell ein optimales Hydrolyse-Verfahren zu entwickeln. Andererseits können stark miniaturisierte und parallelisierte Reaktionssysteme wie beispielsweise Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten1,5-6,11-12 nur bedingt mit Standard-Rührkesselreaktoren verglichen werden. Des Weiteren erweisen sich geschüttelte Mikrotiterplatten durch das besonders geringe Reaktionsvolumen als nachteilig bei der Homogenisierung von suspendierten Pflanzenmaterialien mit hohem Feststoffanteil und mit großen Partikelabmessungen. 

Einen neuen Ansatz zeigen Weuster-Botz et al.14 mit Rührkesselreaktoren im Millilitermaßstab auf. Diese Bioreaktoren zeichnen sich durch zum Labor- oder Produktionsmaßstab vergleichbare verfahrenstechnische Eigenschaften aus, wodurch bereits in vielen Fällen eine direkte Skalierbarkeit von mikrobiellen Prozessen erreicht werden kann. Neben unterschiedlichen biotechnologischen Prozessen mit Escherichia coli, Bacillus subtilis und Cupriavidus necator4,7-8,13 konnte dies auch für Prozesse mit dem Mycelbildner Streptomyces tendae3 und der Hefe Saccharomyces cerevisiae2 gezeigt werden. Die 48-fach parallel angeordneten Reaktoren ermöglichen ein effizientes biotechnologisches Arbeiten im Hochdurchsatz, weshalb sie auch eine interessante Möglichkeit für die Untersuchung von enzymatischen Verzuckerungsreaktionen in den Biomassesubstraten darstellen. 

Um Biomassesuspensionen mit hohem Feststoffanteil von bis zu 20% (w/w) und Partikelgrößen von mehreren Millimetern im Milliliter-Rührreaktor enzymatisch hydrolysieren zu können, wurde ein neues Rührorgan („S-Rührer“9) für die gleichmäßige Homogenisierung entwickelt. Dies ermöglicht erstmals zum Standard-Rührkesselreaktor vergleichbare reaktionstechnische Untersuchungen der enzymatischen Feststoffhydrolyse in 48-fach miniaturisierten Rührkesselreaktoren10

48-fach paralleles Rührkesselreaktorsystem

Das 48-fach parallelisierte Rührkesselreaktorsystem (2mag AG, Abb. 1b) ist modular aufgebaut. Neben einem Grundkörper mit 48 Positionen für Einwegbioreaktoren, integriertem induktiven Antrieb sowie einer Temperierung ermöglichen 48 parallel angeordnete, gleitend gelagerte Rührorgane die effektive Homogenisierung der Biomassesuspension. 

Für die Homogenisierung der Biomassesuspension wird, wie in Abbildung 1a veranschaulicht, das neue Rührorgan „S-Rührer“ in Milliliter-Bioreaktoren eingesetzt. In die Rührorgane sind zwei Dauermagnete integriert, um diese magnetisch-induktiv in Rotation versetzen zu können. Die Rührerdrehzahl kann über ein Steuergerät zwischen 60 min–1 und 4000 min–1 eingestellt werden. Die S-förmige Geometrie des Rührers entsteht durch zwei gegenüberliegende Rührpaddel. Diese erzeugen bei Rotation eine tangentiale und axiale Strömung des Rührmediums und durchmischen so die Suspension. 

Für hohe Feststoffkonzentrationen und große Partikelgröße der Pflanzenmaterialien sind Einweg-Bioreaktoren ohne Strömungsbrecher zu bevorzugen. Das Arbeitsvolumen liegt zwischen 8 ml und 15 ml und ist somit ausreichend groß für die mehrfache Probennahme. Die Probennahme kann manuell oder automatisiert mit Hilfe eines Pipettierroboters durch den Deckel des Rührkesselreaktionssystems erfolgen.

Homogenisierung und enzymatische Hydrolyse von Pflanzenmaterialien

Um eine schnelle Verzuckerung der suspendierten Pflanzenmaterialien durch enzymatische Hydrolyse zu erreichen, ist eine gleichmäßige Homogenisierung der Suspension notwendig. Über Mischzeitexperimente konnte die Homogenisierung im Milliliter-Rührreaktor untersucht und bewertet werden (Abb. 2a). Selbst für geringe volumenbezogene Leistungseinträge kleiner 0,2 W L–1 konnte eine schnelle Durchmischung (97% Homogenität) für Wasser, mikrokristalline Zellulose (20%) und Weizenstroh (5%) festgestellt werden. 

Pflanzenmaterialien wie Weizenstroh bestehen größtenteils aus Lignozellulose. Diese enthält neben Zellulose und Lignin auch große Mengen an Hemizellulose. Deshalb sind neben Zellulasen auch Hemizellulasen als Enzyme für die enzymatische Hydrolyse von Biomasse interessant. Da die Ausbeute der Monosaccharide beim rohem Pflanzenmaterial meist auf maximal 20% beschränkt ist, sind Substrat-Vorbehandlungen notwendig. Für Weizenstroh mit etwa 2 mm Faserlänge wurde die enzymatische Hydrolyse nach hydrothermischer Vorbehandlung (160 °C; 1 h) und nach chemisch-thermischer Vorbehandlung (135 °C; 0,5 h) mit Schwefelsäure (1% v/v) im gerührten Milliliter- und Liter-Maßstab bei vergleichbaren Mischzeiten untersucht. Zusätzlich wurde reine mikrokristalline Zellulose hydrolysiert. Es konnte gezeigt werden, dass Suspensionen mit 20% Feststoffanteil mikrokristalliner Zellulose und 8% vorbehandeltem Weizenstroh gleichmäßig homogenisierbar und somit für eine effektive enzymatische Hydrolyse von suspendierten Pflanzenmaterialien einsetzbar sind. Für die freigesetzten Monosaccharide konnten bei vergleichbaren Durchmischungskennzahlen im Milliliter-Rührreaktor nahezu identische Glukose-Freisetzungen zum Standard-Rührkesselreaktor im Liter-Volumen erreicht werden (Abb. 2b).

Fazit

Mit den neu entwickelten, 48-fach parallelisierten Rührreaktoren im Milliliter-Maßstab ist es erstmals möglich, Feststoffanteile und Partikelgrößen vergleichbar zum Liter-Maßstab enzymatisch zu Monosacchariden zu hydrolysieren. Damit konnte ein schnelles und effizientes Verfahren zur Evaluierung und Optimierung enzymatischer Hydrolysen von Pflanzenmaterialien entwickelt werden. Vergleichbare verfahrenstechnische Parameter, wie Leistungseintrag oder Durchmischung ermöglichen eine einfache Maßstabsvergrößerung vom Milliliter- in den Liter-Maßstab. Eine Automatisierung ist einfach mit einem Pipettierroboter möglich. 


Literatur

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[2] Gebhardt G (2010): Reaktionstechnische Untersuchungen von rekombinanten Saccharomyces cerevisiae zur Bernsteinsäureherstellung. Dissertation. Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik. Technische Universität München

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[5] Jäger G, Wulfhorst H, Zeithammel EU, Elinidou E, Spiess AC, Büchs J (2011): Biotechnol J 6:1-12

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[14] Weuster-Botz D, Puskeiler R, Kusterer A, Kaufmann K, John GT, Arnold M (2005): Bioprocess Biosyst Eng 28: 109-119.

 

Korrespondenzadressen

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Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz
Dipl.-Ing. Peter Riedlberger
Boltzmannstraße 15
85748 Garching

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