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Paperwelt

Mit oxBS-Seq auf der Jagd nach Hydroxymethylcytosin

Eine Form der epigenetischen Regulierung ist das Anhängen von Methylgruppen an die Base Cytosin. Erst kürzlich wurde gezeigt, dass das aber noch nicht das Ende der Modifikationen ist. Neben der „fünften Base“ 5-Methylcytosin (mC) gibt es noch eine sechste (5-Hydroxymethylcytosin, hmC), siebente (5-Formylcytosin, fC) und achte (5-Carboxycytosin, cC). Die Entdeckung von hmC in Säugetieren ist von großer Bedeutung für die Epigenetik. Sie zeigt, dass die Methylierung von Cytosin kein finaler Schritt zur Stummschaltung von Genen ist, andere Funktionalisierungen mit Regulatoraufgaben sind möglich. 

Wie weit hmC verbreitet ist, ist allerdings schwierig herauszufinden. Es wird angenommen, dass der hmC-Gehalt von Gewebe zu Gewebe variiert – ganz im Gegensatz zu einem weitestgehend konstanten mC-Spiegel. Die höchsten Werte für hmC wurden im zentralen Nervensystem gefunden. Außerdem ist hmC wohl an der Regulierung der Pluripotenz von Stammzellen beteiligt. Trotzdem ist noch nicht abschließend geklärt, ob hmC ein wichtiger epigenetischer Marker per se ist – oder vielmehr ein Intermediat eines aktiven Demethylierungsprozesses hin zum unmethylierten Cytosin. Mit der von Reik und Balasubramanian entwickelten oxidativen Bisulfit-Sequenzierung (oxBS-Seq) ist nun erstmals eine Methode verfügbar, mit der alle hmCs des Genoms quantitativ und einer Auflösung auf Einzelbasenniveau erfasst werden können. 

Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution, Science 2012 Mai 18, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937

LABORWELT:

Wie ist die oxBS-Seq-Methode entstanden?

Reik: 

Als die neuen Modifikationen entdeckt wurden, kam natürlich die Frage auf, wie man jene Stellen im Genom nachweisen kann. Wo sind sie? Wieviele gibt es? Wir haben zunächst mit Antikörpern gegen hmC gearbeitet (ähnlich ChIP-Seq). So konnten wir die hydroxymethylierten DNA-Fraktionen mit Hilfe gebundener Antikörper isolieren und dann selektiv sequenzieren. Das funktionierte ganz gut, allerdings ist die Auflösung mit 50 bis 100 bp nicht besonders überzeugend. Außerdem ist die ChIP-Seq nicht quantitativ.

Die Methode, die es für die Bestimmung von mCs schon gab, die Bisulfit-Sequenzierung, ist im Gegensatz dazu quantitativ, bei einer hohen Auflösung. Allerdings war das Problem, dass mC und hmC auf Bisulfit genau gleich reagieren – nämlich gar nicht. Man kann sie nicht unterscheiden. Wir fragten uns dann: Gibt es einen Weg, die Grundidee der Bisulfitmethode beizubehalten, aber die Chemie so zu modifizieren, dass die Methyl- und Hydroxymethylgruppen getrennt bestimmt werden können?

Ein Ansatz war, hmC selektiv zu Formylcytosin (fC) zu oxidieren. fC reagiert mit Bisulfit wie unmethyliertes Cytosin – zu Uracil. Nur die Bisulfit-resistenten mCs bleiben in der Sequenz übrig. Die Gruppe um Shankar Balasubramanian fand dann tatsächlich eine Chemikalie, die diese Reaktion selektiv vermittelt. Jetzt war der Weg frei. Wir haben zwei parallele Sequenzierungsreaktionen gemacht – eine mit der Chemikalie, die andere ohne. Subtrahiert man die Ergebnisse dann voneinander, erhält man eine Sequenz, die Cytosine, Methylcytosine und Hydroxymethylcytosine aufweist – quantitativ und auf Einzelbasenniveau.

LABORWELT:

Könnte man die anderen Cytosinmodifikationen auf ähnliche Weise bestimmen?

Reik:

Genau, mit der gleichen Logik kann man in verschiedene biochemische Richtungen gehen, vorausgesetzt natürlich, entsprechende, selektive Chemikalien sind gefunden.

 

LABORWELT:

Unterscheiden sich hmC und mC funktionell?

Reik: 

Wenn alle Cytosinmodifikationen ihre eigenen Signalfunktionen haben, dann sollte es Proteine geben, die sie spezifisch erkennen können. Da solch ein Protein für hmC noch nicht bekannt ist, kann meine Antwort nur vorläufiger Natur sein: Es sieht so aus, als ob hmC einen weniger repressiven Einfluss auf die Genregulation hat, als mC. Mehr kann man aber noch nicht sagen.

LABORWELT:

Was haben Sie bei der Analyse der Cytosinmodifikationen der DNA embryonaler Mausstammzellen herausgefunden?

Reik:

Im Wesentlichen haben wir uns bei der Sequenzierung auf die CpG-Inseln (CGIs) fokussiert – und nicht das gesamte Genom sequenziert. Dabei haben wir drei CGI-Arten mit jeweils unterschiedlichen Mustern von Cytosinmodifikationen gefunden. Die interessanteste davon: CpG-Inseln, die sowohl mC als auch hmC aufweisen.

Wir haben 800 von diesen CGIs innerhalb von und zwischen den Genen gefunden, aber nicht in den Promotorregionen. Diese Inseln werden gezielt von bestimmten Oxidasen, den sogenannten TET-Enzymen, bearbeitet. Hier wird viel mC produziert, das von den TET-Enzymen gleich in hmC umgewandelt wird. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei um einen Zyklus, der nach jeder Zellteilung von vorn losgeht. Eine solche konstante Reprogrammierung ist charakteristisch für pluripotente Zelltypen.

In ausdifferenzierten Geweben stellen wir uns vor, dass die Modifikationen innerhalb der CGIs einen Endzustand erreicht haben. Interessant ist, dass das Wiederherstellen eines solchen Mittelzustandes eine Möglichkeit zur Reprogrammierung von Gewebestammzellen hin zu pluripotenten Stammzellen sein könnte. Daran arbeiten wir bei uns im Labor derzeit. 

Kontakt: 

Wolf Reik, wolf.reik[at]babraham.ac.uk

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Heft 2/2012

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http://www.laborwelt.de/spezialthemen/epigenetik/oxbs-sequenzierung.html

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