Thema:

DNA-Methylierung

Mit Elektrophorese einen Blick auf die DNA werfen

Bei einigen Krebsarten – unter anderem Gebärmutter- und Eierstockkrebs sowie bösartigen Prostatatumoren – wurde ein Zusammenhang zwischen dem Methylierungsgrad (Verhältnis Methylcytosin zu Gesamtcytosin) einiger Gene und dem Auftreten der Krankheit beobachtet1-3. Eine globale Hypomethylierung bei zugleich stattfindender lokaler Hypermethylierung führt zur Deaktivierung von Tumorsuppressorgenen, was dem Beginn einer Krebserkrankung gleichzusetzen ist4. Globale DNA-Hypomethylierung ist bedeutsam, da sie mechanistisch in die Veränderung der DNA eingreift5. Durch den verringerten Methylierungsgrad können zum Beispiel Onkogene gezielt aktiviert werden. Diese Veränderungen erhöhen die Möglichkeit, an Krebs zu erkranken und sind somit entscheidend in der Diagnostik.

Zur Bestimmung des genomweiten Methylierungsgrades sind verschiedene analytische Methoden bekannt6. In den neunziger Jahren wurden verschiedene bioanalytische Verfahren entwickelt, die entweder auf Assays beruhen oder Antikörper nutzen. Eine Zeit lang wurden standardmäßig die Verhältnisse der Mononukleotide nach enzymatischer Hydrolyse bestimmt. Das Verhältnis zwischen Cytosin und 5-Methylcytosin kann auf verschiedene Weise analysiert werden. Die Trennung der Analyten ist zum Beispiel mit HPLC und die anschließende Quantifizierung mit UV-Detektion bei 254 nm möglich. Ein Verfahren, das deutlich weniger Probenmenge erfordert, ist die Separation durch Kapillarelektrophorese. Weitere Vorteile der Kapillarelektrophorese im Vergleich zu HPLC-Methoden sind die schnellere Durchführung und die geringeren Kosten aufgrund des nicht vorhandenen Fließmittelverbrauchs. 

Schmitz et al. haben eine hochsensitive kapillarelektrophoretische Methode entwickelt, bei der durch Einsatz von Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion die Probenmenge weiter reduziert werden kann7. Das Verfahren beruht auf der Gewinnung der Analyten in einem dreistufigen Verfahren. Zunächst wird die DNA mit Mikrokokkennuklease in Mono-, Di- und Trinukleotide gespalten, die alle eine endständige 5’-Hydroxygruppe aufweisen. Diese werden durch Phosphodiesterase Typ II in 2’-Desoxynukleosid-3’-monophosphate umgewandelt. Die Bildung dieser Mononukleotide ist die Grundlage der weiteren Kopplungsreaktion mit dem Fluoreszenzfarbstoff BODIPY®. Dieser wird kovalent mit den Mononukleotiden verknüpft, und die Produkte können nach einer micellaren kapillarelektrophoretischen Trennung bei 502 nm angeregt werden. Das bei 511 nm auftretende Emissionsmaximum ist frei von Matrix- oder anderen Interferenzen und somit hochselektiv für die Analyten. 

Das gesamte Verfahren weist gegenüber anderen Analysemethoden einige Vorteile auf: Durch Verwendung der micellaren elektro-kinetischen Chromatographie (MEKC) lassen sich die relativ unpolaren Analyten sehr gut auftrennen. 

Die Anwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs führt zur Absenkung der Quantifizierungs- und Bestimmungsgrenze. Gerade die hohen Anregungs- und Emissionswellenlängen sowie die geringe Stokes-Verschiebung machen BODIPY® zu einem idealen Reagenz für die DNA-Analytik, bei der stets nur sehr geringe Probenmengen vorliegen. Die primäre Aminfunktion von BODIPY® ermöglicht die Bildung eines Phosphorsäureamids mit den vorliegenden Nukleosid-Monophosphaten. Für diese Reaktion gibt es keine Konkurrenzreaktionen, da keine weiteren Säuren vorliegen8. Schließlich ist für eine Analyse lediglich eine Probenmenge von 1 µg DNA erforderlich, was ein erheblicher Vorteil gegenüber anderen Analyseverfahren ist.

HEK 293-Zellen als Testsystem

Zur Bestimmung von Veränderungen des Methylierungsgrades von HEK 293-Zellen wurde von uns die vorgestellte Methode angepasst und modifiziert9. Die Trennspannung wurde zur Verkürzung der Migrationszeiten der Analyten auf 25 kV heraufgesetzt. Dadurch konnte ein Durchgang einschließlich Spülschritten in weniger als 45 Minuten abgeschlossen werden. Zudem wurde der Trennpuffer optimiert. Um reproduzierbare Migrationszeiten zu erhalten, musste für jeden Analysendurchgang frischer Trennpuffer eingesetzt werden.

Dies war nötig, da eine Trennung von 45 Minuten bereits zu einer erheblichen Veränderung der Ionenkonzentration im Puffer führte, die wiederum eine Verschiebung der Migrationszeiten verursachte. Die optimierte Methode wurde anschließend validiert, um sie zur Analyse des Methylierungsgrades unterschiedlich behandelter Zelllinien einzusetzen.

Die Validierung erfolgte mit zwei synthetisch hergestellten Oligomeren, die jeweils 25% Cytosin, Guanin, Adenin und Thymin enthielten. Während das eine Oligomer frei von Methylcytosin war, wies das andere einen Methylierungsgrad von 10% auf. Durch Mischen wurden Methylierungsgrade von 0,00%, 2,00%, 4,00%, 6,00%, 6,48% und 10,00% exakt eingestellt.

Anschließend wurde jede Mischung wie beschrieben hydrolysiert, mit BODIPY® verknüpft und analysiert. Für jedes Nukleotid wurde der bestimmte Anteil durch den tatsächlich enthaltenen Anteil geteilt, um den Detektionsfaktor jedes einzelnen Nukleotids zu ermitteln. Dieser enthält alle Einflüsse durch nukleotidspezifische Abweichungen im enzymatischen Prozess, in der Konjugation mit BODIPY® und in der Fluoreszenzquantenausbeute. Der Regressionskoeffizient der erhaltenen Kalibrationsgerade lag bei 0,989, was einen sehr guten Wert für biologische Proben darstellt.

Diese Kalibrationsgerade mit den ermittelten Detektionsfaktoren wurde verwendet, um den Methylierungsgrad der behandelten Zellen zu untersuchen. Zwei HEK 293-Zelllinien wurden hierbei mit unterschiedlichen Konzentrationen von Methotrexat oder Pemetrexed behandelt. Beide Stoffe sind Folsäure-Analoga, die bereits erfolgreich in der Krebstherapie eingesetzt werden10. Es sollte untersucht werden, ob diese beiden Zytostatika den Methylierungsgrad der Zellen verändern. Die Zelllinien wurden mit 0,05 µM und 0,1 µM der Arzneistoffe versetzt und 24 sowie 72 Stunden inkubiert. Zudem wurde eine unbehandelte Probe nach 0, 24 und 72 Stunden als Referenzprobe entnommen. Die DNA der resultierenden Proben wurde extrahiert und mit der beschriebenen Methode analysiert. 

Zur Überprüfung dieses Versuchsaufbaus wurden HEK 293-Zellen mit Azacytidin über 0, 24, 48, 72 und 96 Stunden behandelt. Als Cytosin-Analogon senkt dieser Wirkstoff nachweislich den Methylierungsgrad und kann somit als Positiv-Kontrolle verwendet werden. 

Reproduzierbare Ergebnisse

Durch Behandlung der Zellen mit Pemetrexed wurde der Methylierungsgrad geringfügig, aber signifikant erhöht. Ein vergleichbares Ergebnis wurde nach Behandlung der Zellen mit Metho-trexat erhalten. Azacytidin führte zu der erwarteten deutlichen Senkung des Methylierungsgrades. Innerhalb von 96 Stunden wurde der Methylierungsgrad von 4,61% auf 1,38% gesenkt (vgl. Abb. 1). Das beobachtete Signal-zu-Rausch-Verhältnis ermöglicht eine problemlose Auswertung der Elektropherogramme, auch bei einem geringen Methylierungsgrad von 1,38% (vgl. Abb. 2). Die Betrachtung der einzelnen Werte und der dazugehörigen Standardabweichungen zeigt die gute Anwendbarkeit und Reproduzierbarkeit der Methode. 

Die Kalibrationsgeraden weisen geringe relative Standardabweichungen auf. Die relativen Standardabweichungen der Mononukleotide überschreiten 3,6% nicht. Lediglich 5-Methylcytosin, dessen absolute Signalgröße deutlich unter denen der übrigen Nukleotidsignale liegt, weist eine relative Standardabweichung von 14,9% auf. Auch dieser Wert liegt im Bereich der Richtlinien der Industrie für die Validierung von bioanalytischen Methoden12.

Bei allen mit Wirkstoffen versetzten Proben lagen die Standardabweichungen stets unter 0,25%. Dieser niedrige Wert zeigt deutlich, dass auch geringe Veränderungen im Methylierungsgrad präzise analysiert werden können. Durch die Verwendung der vorgestellten Methode können somit kleine Änderungen des Methylierungsgrades schnell und exakt bestimmt werden. Aufgrund der geringen benötigten Probenmenge lässt sich der Methylierungsgrad von DNA aus verschiedenen Zellen problemlos untersuchen. 

 

Literatur

[1] S. Apostolidou, R. Hadwin, M. Burnell, A. Jones, D. Baff, N. Pyndiah, T. Mould, I. J. Jacobs, S. Beddows, G. Kocjan, M. Widschwendter, Int. J. Cancer 2009, 125, 2995-3002.

[2] C. Balch, F. Fang, D. E. Matei, T. H.-M. Huang, K. P. Nephew, Endocrinology 2009, 150, 4003-4011.

[3] R. L. Collard, N. S. Harya, F. A. Monzon, C. E. Maier, D. S. O‘Keefe, The Prostate 2006, 66, 687-695.

[4] C. A. Barton, N. F. Hacker, S. J. Clark, P. M. O‘Brien, Gynecologic Oncology 2008, 109, 129-139.

[5] A. P. Peinberg, B. Tycko, Nature reviews 2004, 4, 143-153.

[6] P. Dahl, P. Guldberg, Biogerontology 2003, 4, 233-250.

[7] R. Schiewek, M. Wirtz, M. Thiemann, K. Plitt, G. Vogt, O. J. Schmitz, J. Chromatogr. B 2007, 850, 548-552.

[8] O. J. Schmitz, C. C. T. Worth, D. Stach, M. Wiessler, Angew. Chemie Int. Ed. 2002, 41, 445-448.

[9] E. Falck, A. Groenhagen, J. Mühlisch, G. Hempel, B. Wünsch, Anal. Biochem. 2012, 421, 439-445.

[10] J. Walling, Invest. New Drugs 2006, 24, 37-77.

[11] S. Hagemann, O. Heil, F. Lyko, B. Brueckner, PLoS One 2011, 6 (3), e17388.

[12] ICH-Q2A: Guidline for Industry – Text on Validation of Analytical procedures 1995 & 1996.

Korrespondenzadresse

Dipl.-Chem. Evamaria Falck, Prof. Dr. Bernhard Wünsch
Institut für Pharmazeutische und Medizinische Chemie
Westfälische Wilhelms-Universität Münster
Hittorfstr. 58-62, 48149 Münster
Tel.: +49-(0)251-83-33310

evamariafalck[at]uni-muenster.de
wuensch[at]uni-muenster.de

Mehr zum Spezial

Magazin zum Thema


Heft 2/2012

© 2007-2017 BIOCOM

http://www.laborwelt.de/spezialthemen/epigenetik/mek-chromatographie.html

Alle Themen

SpezialThemen

Produkt der Woche

Alle Produkte

Kalender

Alle Events

Partner-Events

Glasgow (UK)

DIA BioVenture Day

Istanbul (TR)

expomed eurasia