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ChlP im Lebendgewebe – ein Überblick

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-Assays ermöglichen, die Wechselwirkungen von nukleären Proteinen und chromatisierter DNA in lebenden Zellen routinemäßig zu analysieren. Die ChIP-Technik kann hierbei für ein breites Spektrum von Fragestellungen, wie zum Beispiel der genspezifischen oder genomweiten Lokalisation von Histonmodifikationen, Transkriptionsfaktoren und anderer Chromatin-bindender Faktoren, eingesetzt werden. Aufgrund der hohen zellulären und funktionellen Komplexität des Gehirns haben in vivo-ChIP-Experimente im Bereich der neurobiologischen Forschung vergleichsweise wenig Beachtung gefunden. Der Grund hierfür ist oftmals die geringe Menge an Ausgangsmaterial. Daher ist eine sorgfältige Optimierung der einzelnen ChIP-Arbeitsschritte geboten.

ChIP-Nachweisverfahren basieren darauf, dass an die chromatisierte DNA gebundene Proteine durch eine kurze Behandlung mit Formaldehyd fixiert werden. Hierbei werden Protein-Chromatin-Bindungen im Bereich von 2 Å (1 Å entspricht 10–10 m) gleichsam in einer Momentaufnahme festgehalten. Die fixierten Protein-Chromatin-Komplexe werden anschließend geschert (300 bis 600 Basenpaare) und mit Antikörpern gegen das zu untersuchende Protein immunpräzipitiert. Danach wird die DNA aus den Immunkomplexen aufgereinigt und mit (gen-)spezifischen Primern amplifiziert (Abb. 1). Alternativ kann die immunpräzipitierte DNA als Hybridisierungsprobe in Microarray-Experimenten (ChIP-on-chip) oder in Sequenzierungen (ChIP-seq) eingesetzt werden. 

Neurobiologie: in vivo-ChIP heikel

Die überschaubaren technischen, apparativen und zeitlichen Anforderungen haben zur raschen Verbreitung dieser Technik beigetragen. Ungeachtet dieser raschen Fortschritte haben in vivo-ChIP-Experimente im Bereich der neurobiologischen Grundlagenforschung vergleichsweise wenig Anklang gefunden. Die Gründe liegen an erster Stelle an der außerordentlich hohen zellulären und funktionellen Komplexität des Gehirns.

Um aussagekräftige Experimente durchführen zu können, ist es notwendig, die zu untersuchende Gehirnregion klar abzugrenzen. Andernfalls kann es zum Beispiel aufgrund einer stark abweichenden Genexpression in angrenzenden Geweben zur Verfälschung von ChIP-Ergebnissen kommen. Dies bedeutet in der Praxis, dass Gehirnschnitte der Untersuchungsprobe gefärbt und lichtmikroskopisch beurteilt werden, bevor anschließend gezielt Gewebe entnommen wird.

Für das ChIP-Experiment steht daher häufig äußerst wenig Ausgangsmaterial zur Verfügung. Bei der Isolierung spezifischer Zellkerne des Hypothalamus ist zum Beispiel die Ausbeute auf mehrere tausend Zellen beschränkt. Sollen zudem Neurone von Gliazellen und Astrozyten getrennt werden, ist darüber hinaus eine Auftrennung anhand zellspezifischer Marker notwendig (z.B. mittels FACS-Analyse). 

Wir haben daher verschiedene ChIP-Protokolle bezüglich ihrer Eignung für in vivo-ChIP- Experimente getestet und stellen hier die Vor- und Nachteile der einzelnen Methoden vor. Zudem präsentieren wir ein optimiertes Protokoll zur Bearbeitung mehrerer Proben bei vergleichsweise geringem Arbeitsaufwand. 

ChIP – erst „Fast“, dann „Rapid“

Die ersten ChIP-Protokolle wurden vor annähernd 25 Jahren entwickelt und schrittweise einer wachsenden Zahl von neuen Anwendungen angepasst. Wir beschränken uns hier auf jene Modifikationen, die im Hinblick auf in vivo-ChIPs von neuronalen Geweben interessant sind. 

Die Entwicklung des „Fast ChIP“-Protokolls führte zu einer deutlichen Zeitersparnis bei gleichzeitig verringertem Arbeitsaufwand. Bei dieser Methode erfolgt die Inkubation des Antikörpers mit dem Protein-Chromatin-Komplex in einem Ultraschallwasserbad und kann so von mehreren Stunden (häufig über Nacht) auf bis zu 15 min reduziert werden. Im Anschluß an einen Proteinase K-Verdau erfolgt die Umkehrung der Protein-Chromatin-Fixierung während einer 10-minütigen Inkubation bei 100°C in Gegenwart von Chelex 100. Die aus dem Überstand isolierte DNA kann ohne weitere Aufreinigungsschritte in nachfolgenden PCRs verwendet werden. Auch wenn dieses Fast ChIP-Protokoll innerhalb eines Tages durchgeführt werden kann, erfordert die geringe DNA-Ausbeute vergleichsweise viel Ausgangsmaterial (0,5-1 x 106 Zellen). 

Eine Modifikation dieses Protokolls, das sogenannte „Rapid ChIP“-Protokoll, sieht die direkte Durchführung der PCR-Analyse mit dem immunpräzipitierten, Protein G-Partikel gebundenen Material vor (bead-PCR). Die Anwendung dieses Protokolls führte in unseren Versuchen jedoch zu unbeständigen Ergebnissen, da bei kleinen Gewebeproben die Menge der immunpräzipitierten DNA häufig unter dem Detektionslimit lag.

Zudem spielt die Auswahl der verwendeten Protein A/G-Partikel für den Einsatz in quantitativen PCR-Analysen eine kritische Rolle. So wurde berichtet, dass die Verwendung von magnetischen Partikeln die Quantifizierung des SYBR-Green-Signals beeinträchtigt. 

Mit der Einführung des EpiQuik ChIP Kit (Epigentek) gelang ein wichtiger Schritt in Richtung eines Hochdurchsatz-Protokolls. Dieser Ansatz im Mikroplattenformat basiert auf deutlich verkürzten Immunpräzipitations- und Waschschritten, wobei zwischen den Arbeitsabschnitten kein Probentransfer erforderlich ist. Auch wenn sich diese Methode potentiell für die Automatisierung von ChIPs anbietet, stellt die Menge an benötigtem Ausgangsmaterial (mindestens 500.000 Zellen) für viele neurobiologische Fragestellungen ein Ausschlusskriterium dar.

CChIP: Die nächste (kleinere) Dimension

Die Einführung des „Carrier ChIP“ (CChIP) ermöglichte erstmals die Aufarbeitung von Proben mit geringer Zellzahl, wobei Chromatin von Drosophila als Träger (engl. carrier) zum Einsatz kam. Die damit verbundene Reduzierung des Reaktionsvolumens erlaubte eine erhöhte Rückgewinnung des Ausgangsmaterials bei gleichzeitiger Verringerung des Hintergrundsignals. Allerdings ist der Einsatz sorgfältig optimierter Primer für die PCR-Analyse erforderlich, um die zu untersuchende DNA sicher von der eingesetzten Träger-DNA abzugrenzen. Entsprechende Einschränkungen ergeben sich für ChIP-on-chip- und ChIP-seq-Anwendungen. Da die CChIP in ihrer ursprünglichen Form mit nativem (unfixiertem) Chromatin durchgeführt wurde, erschwert es zudem die Untersuchung des Bindungsverhaltens von Transkriptionsfaktoren.

Eine Weiterentwicklung der CChIP-Technik stellt das „Fast CChIP“-Protokoll dar, wobei die Vorteile der Fast ChIP und der CChIP vereint wurden. Unter Verwendung von Chromatin der Hefe (Saccharomyces cerrevisiae) als Träger gelang es, Protein-DNA-Interaktionen in kleinen Gehirnstanzen (0,2 mm3) zu untersuchen. Damit wurde erstmalig nachgewiesen, dass die ChIP zur Untersuchung sehr kleiner Gewebeproben genutzt werden kann, auch wenn der Einsatz von Träger-Chromatin den Bereich potentieller  Anwendungen weiterhin einschränkte. 

Ein weiterer wichtiger Schritt auf dem Weg zur Untersuchung geringer Zellzahlen ist die „Micro ChIP“ (µChIP). Dieses Protokoll beschreibt die Untersuchung von Chromatin aus 1.000 Zellen bei Verzicht auf zusätzliches Trägermaterial. Überdies eignet sich die µChIP zur Analyse sehr kleiner Gewebeproben (1 mm3) und kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden.

Optimiertes Protokoll

Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass die ursprüngliche ChIP-Methode in den vergangenen 20 Jahren kontinuierlich weiterentwickelt wurde, wobei ein besonderes Augenmerk auf der Verringerung der Menge an benötigtem Ausgangsmaterial lag. Durch eine verbesserte Abstimmung einzelner Arbeitsschritte dieser Protokolle, gelang es uns, die Effizienz für ChIP- Experimente mit sehr kleinen Gewebeproben weiter zu steigern.

Die wesentlichen Gesichtspunkte sollen hierbei beispielhaft anhand der Untersuchung des Bindungsverhaltens des Methyl-CpG-Bindungsproteins 2 (Mecp2) an die Verstärkerregion (engl. enhancer) des Gens AVP – den Bauplan für das Peptidhormon ADH (Antiduretisches Hormon) – beleuchtet werden.

Als Ausgangsmaterial verwendeten wir eine 1 mm3 kleine Gewebsstanze des hypothalamischen Nucleus paraventricularis (PVN) der Maus (Abb. 2). Nach Homogenisation des Gewebes wurden die Protein-Chromatin-Komplexe mittels Formaldehyd fixiert. Für eine optimale Anreicherung des Chromatins werden Zell- und Kernmembran in zwei getrennten Schritten aufgebrochen und die zytoplasmatische Fraktion verworfen. Anschließend wird das Chromatin mittels Ultraschallbehandlung (z.B. Biorupter, Diagenode) fragmentiert. Hierbei ist eine ungleichmäßige Exposition und Überhitzung der Probe sorgfältig zu vermeiden.

Für eine hohe spezifische Bindung des Antikörpers wird das Chromatingemisch verdünnt (wobei 1% des Ausgangsmaterials als „Input“ für die spätere Quantifizierung der immonopräzipitierten DNA zurückbehalten wird), über Nacht mit dem Mecp2-Antiserum inkubiert und am darauffolgenden Tag mit magnetischen Protein G-Partikeln präzipitiert. In unserem Protokoll erfolgt die Umkehrung der Protein-Chromatin-Fixierung sowie ein Proteinase K-Verdau innerhalb von 2 h in einem einzigen Schritt bei 62°C. Für die abschließende Aufreinigung der DNA im Überstand verwenden wir Zentrifugationssäulen (Ultra Clean PCR Clean-Up Kit, MoBio) anstelle einer Phenol/Chloroform-Extraktion und DNA-Präzipitation. Die so gewonnene DNA kann dann für weitere Fragestellungen, zum Beispiel zur quantitativen PCR Analyse, verwendet werden. 

Die in diesem Protokoll vorgestellten Modifikationen gestatten die synchrone Bearbeitung mehrerer, sehr kleiner Gewebeproben bei geringem Zeit- und Arbeitsaufwand. Damit eignet sich dieser Ansatz vorzüglich zur Analyse von spezifischen Gehirnregionen größerer Untersuchungsgruppen von Nagern, die verschiedenen Versuchsbedingungen ausgesetzt wurden. 

Stress zerstört Epigenetik-Markierung

So gelang es zum Beispiel unserer Gruppe mit Hilfe eines Mausmodells für frühkindlichen Stress die Rolle des Proteins Mecp2 hinsichtlich der epigenetischen Regulation des Stressgens AVP zu untersuchen. Hierbei wurden neugeborene Mäuse während der ersten zehn Tage jeweils täglich für drei Stunden von ihren Müttern getrennt. Die Untersuchung des hypothalamischen PVN dieser Mäuse im Alter von sechs Wochen offenbarte eine deutlich geringere Methylierung der CpG-Insel im Bereich der Verstärkerregion des AVP-Gens im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, welche nicht von ihren Müttern getrennt wurde.

Diese geringere Methylierung konnte auch noch im Alter von drei Monaten sowie einem Jahr nachgewiesen werden und spiegelte sich in einer erhöhten Expression des AVP-Gens wider. Hierbei konnten wir mit Hilfe der in vivo-ChIP- Technik eine geringere Bindung von Mecp2 an der AVP-Verstärkerregion bei sechs Wochen alten Mäusen, welche nach der Geburt zeitweise von ihren Müttern getrennt wurden, nachweisen (Abb. 3) und neue Erkenntnisse bezüglich der AVP-Regulierung gewinnen. Dieses Beispiel verdeutlicht, dass die in in vivo-ChIP-Methode im Bereich der neurobiologischen Forschung einen wichtigen Beitrag zur Beantwortung vieler Fragestellungen leisten kann.


Korrespondenzadresse

Dr. med. Dietmar Spengler 
Max-Planck-Institut für Psychiatrie 
Kraepelinstraße 2, 80804 München 
Tel.: +49-(0)-89-30622-587

spengler[at]mpipsykl.mpg.de

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