Thema:

Krebs-Biomarker

Tumordiagnose anhand modifizierter Histone

Post-translationale Modifikationen und alternative Varianten von Histonen spielen bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen eine wesentliche Rolle. Eine Dysregulation der Histonmodifikationen führt zu einer Störung dieser Prozesse und wird mit der Entstehung  von Krebs in Verbindung gebracht. Die modifizierten Histone können sowohl im Tumorgewebe als auch im Blut nachgewiesen werden. Dieser Überblick erläutert die Bedeutung dieser neuen Biomarker-Klasse für die Diagnostik und das Management von Tumorerkrankungen.

Post-translationale Modifikationen und alternative Varianten von Histonen spielen bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen, wie Genexpression, DNA-Replikation und Reparatur, Chromosomen-Kondensation und -Segregation sowie Apoptose, eine wesentliche Rolle. Hierbei ist eine optimal abgestimmte Interaktion mit anderen epigenetischen Veränderungen wie DNA-Methylierungen sowie mit Histon-bindenden Proteinen von Bedeutung. Eine Dysregulation der Histonmodifikationen führt zu einer Störung dieser Prozesse und ist mit der mehrstufigen Entstehung und Progression von Tumorerkrankungen assoziiert. Die modifizierten Histone können sowohl im Tumorgewebe als auch im Blut nachgewiesen werden. Dieser Überblick erläutert die Bedeutung dieser neuen Biomarker-Klasse für die Diagnostik und das Management von Tumorerkrankungen

Neben genetischen Veränderungen spielen epigenetische Modifikationen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und Progression von Tumorerkrankungen. Diese werden stabil an die nächste Zellgeneration vererbt, ohne dass eine Veränderung der DNA-Sequenz vorliegt. Sie umfassen DNA-Methylierungen, Histon-Modifikationen, microRNA-Expression und Chromatin-Remodelling-Prozesse. Lange Zeit standen für die Tumordiagnostik vor allem Hypermethylierungen von Cytosin-Nukleotiden in CpG-Inseln der Promotorregion von Suppressorgenen im Fokus des Interesses. Diese Veränderungen heben bei vielen Tumorarten die Hemmung des Tumorwachstums auf und sind somit funktionell wie auch diagnostisch von Bedeutung.

Einige DNA-Methylierungen auf im Blut zirkulierender DNA zeigen bereits vielversprechende Ergebnisse als Biomarker in der Tumordiagnostik wie zum Beispiel die Septin-9 Hypermethylierung für das kolorektale Karzinom. Im Gewebe von Gliomen ist die Hypermethylierung des O(6)-Methylguanin-DNA Methyltransferase (MGMT)-Promotors ein wichtiger Indikator für das Ansprechen des Tumors auf eine Alkylanzien-basierte Chemotherapie. In den vergangenen Jahren wurde der Einfluss von kurzen regulatorischen microRNA und von Histonmodifikationen für die Entwicklung von Tumorerkrankungen verstärkt untersucht.

Eine Reihe von microRNAs wurden als potentielle diagnostische und prognostische Biomarker im Serum und Plasma von Patienten mit unterschiedlichen Tumorerkrankungen gefunden. Hinsichtlich Histonmodifikationen liegen derzeit überwiegend Ergebnisse aus dem Tumorgewebe vor. In einigen Pilotstudien wurden allerdings bereits Histonmodifikationen auf im Blut zirkulierenden Nukleosomen als potentielle Biomarker für die Tumordiagnostik beschrieben.

Struktur des Chromatins

Im Zellkern ist das humane Chromatin aus nukleosomalen Grundeinheiten aufgebaut (Abb. 1). Die nukleosomalen Histone weisen einen globulären C-Terminus und einen aus den scheibenartigen Nukleosomen herausragenden N-Terminus auf. Diese N-terminalen Endigungen können vor allem an den basischen Aminosäuren Lysin und Arginin, aber auch an Serin und Threonin post-translational modifiziert sein. Die Veränderungen umfassen die kovalente Bindung von Azetyl-, Methyl-, Phosphat-, Ubiquitin-, SUMO-, ADP-Ribose- und Biotingruppen. Zusätzlich liegt eine Graduierung hinsichtlich einer ein-, zwei- und dreifachen Methylierung vor. 

Die Vielfalt der variierbaren Möglichkeiten von Histonmodifikationen spiegelt sich in der „Histon-Code“-Hypothese wider, nach der definierte Kombinationen von Histon-Markierungen zu einer Veränderung der Chromatinstruktur und einer feinen Regulierung des Transkriptionsstatus führen. Für die Modifikationen wurde eine einheitliche Nomenklatur festgelegt. So wird etwa die dreifache Methylierung (me3) des Lysins 9 (K9) auf dem Histon 3 als H3K9me3 bezeichnet. 

Histonmodifizierende Enzyme

Am Anbringen bzw. Entfernen der Modifikationen sind eine Reihe von Enzymen beteiligt, die den funktionellen Status der Histone gezielt beeinflussen: Das Anfügen von Azetylgruppen durch Histon-Azetyltransferasen (HAT) führt zu einer Chromatin-Dekondensierung, wodurch die Bindung von Transkriptionsfaktoren ermöglicht wird, während die Entfernung von Azetylgruppen durch Histon-Deazetylasen (HDAC) eine Kondensation und damit eine transkriptionelle Ruhigstellung der betroffenen Genabschnitte nach sich zieht.

Ob das Einbringen von Methylgruppen durch Histon-Methyltransferasen (HMT) transkriptionsfördernd oder -hemmend wirkt, hängt von den davon betroffenen Histonpositionen ab; der Effekt von Histon-Demethylasen (HDM) ist entsprechend entgegengesetzt. So fördern zum Beispiel Methylierungen von H3K4 und H3K36 die Transkriptionsaktivität während Methylierungen von H3K9, H3K27 und H4K20 diese inhibieren.

Darüber hinaus regulieren Kinasen und Phosphatasen die Phosphorylierung, Ubiquitin-Ligasen und Deubiquitinasen die Ubiquitinylierung von Histonen. Diese Veränderungen spielen neben der Genexpression und Transkription auch bei weiteren zellulären Prozessen wie DNA-Replikation und Apoptose eine wesentliche Rolle.

Vielfältige Interaktionen der verschiedenen Histon-Modifikationen lassen darauf schließen, dass nicht einzelne Veränderungen, sondern eher ganze Modifikationsmuster auf einem Nukleosom im Sinne eines „Nukleosomen-Codes“ den Status der DNA-Sequenz definieren und regulieren: So ist etwa eine Ubiquitinylierung von H2B notwendig für eine Methylierung des Lysins 79 auf H3. Auch wird die Bindung des Heterochromatin Proteins 1 (HP1) am methylierten Lysin 9 auf H3 durch eine Phosphorylierung auf dem benachbarten Serin 10 gelockert und durch Azetylierung auf Lysin 14 ganz gelöst und dadurch die inhibierende Wirkung von H3K9me3 aufgehoben.

Schließlich unterliegen die Modifikationen einer unterschiedlichen Dynamik, wobei die Methylierungen – insbesonders wenn diese mehrfach vorliegen – deutlich stabilere Markierungen sind als Azetylierungen und Phosphorylierungen, die aufgrund ihrer kürzeren Halbwertszeiten variablere Signale darstellen. Histonmodifikationen sind in das Netzwerk epigenetischer Veränderungen eingebunden und werden sowohl durch microRNAs als auch durch DNA-Methylierungen beeinflusst. So interagiert die DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1) mit der Methylierung des Lysins 9 auf H3, wodurch ein stabiler repressiver Transkriptionsstatus erreicht wird.

Neben den Histonmodifikationen treten auch alternative Histonvarianten auf. Anstelle des Histons H2A kann die Variante H2A.Z in transkriptionell aktiven Nukleosomen eingebaut sein, H2A.X als Sensor für eine DNA-Schädigung zur Rekrutierung von DNA-Reparaturkomplexen dienen oder verschiedene MacroH2A-Varianten bei inaktiven X-Chromosomen oder vermehrt bei Tumorerkrankungen gefunden werden. CENP-A ist eine Zentromer-spezifische H3-Variante, während H3.3 ebenfalls in den Promotorregionen aktiver Gene lokalisiert ist.

Tumorspezifische Modifikationsmuster 

Bei Tumorerkrankungen wurden charakteristische Muster von Histonmodifikationen im Tumorgewebe mittels Immunhistochemie (IHC), Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) und Tissue-Microarray (TMA)-Untersuchungen gefunden und mit dem Tumorstadium und der Prognose der Patienten korreliert. Diese Veränderungen sind häufig mit einer aberranten Genexpression, einer genomischen Instabilität sowie mit DNA-Reparatur- und Zellzyklus-Störungen verbunden. Bei diversen Tumorarten trat typischerweise ein globaler Verlust der Azetylierung des Lysins 16 auf H4 (H4K16ac) sowie der Trimethylierung des Lysins 20 auf H4 (H4K20me3) auf, der mit einer DNA-Hypomethylierung auf repetitiven DNA-Sequenzen („Satelliten-DNA“) einherging.

Der dadurch hervorgerufene relaxierte Chromatinstatus ist für eine größere DNA-Instabilität verantwortlich, wodurch sich die Korrelation mit der Progression der Erkrankung erklärt. Eine verminderte Methylierung von H3K4 (H3K4me2 und H3K4me3), verbunden mit einer reduzierten Transkriptionsaktivität, wurde beim Prostatakarzinom gefunden und zeigte ein früheres Auftreten von Rezidiven an.

Hinsichtlich der Modifikationen von H3K9 wurden bei unterschiedlichen Tumorarten konträre Ergebnisse beschrieben. So war ein suppressiver Status durch eine verminderte Azetylierung (H3K9ac) und vermehrte Methylierung (H3K9me3) beim Prostata-, Ovarial- und Magenkarzinom ein ungünstiger prognostischer Parameter, während diese Konstellation bei Astrozytom, Lungen-, Nierenkarzinom und bei hämatologischen Neoplasien günstig war.

Ähnlich unterschiedliche Ergebnisse sind für die repressive Methylierung von H3K27 (H3K27me3) beschrieben, was darauf hinweist, dass einerseits die Balance der beteiligten Enzyme und weiterhin das umfassendere Muster an Modifikationen im „Nukleosomen-Code“ mit der Aggressivität der Erkrankung korreliert. 

Nukleosomen im Blut als Biomarker

In eigenen Untersuchungen wurden eine Korrelation einer erniedrigten Methylierung von H3K4, H3K9 und H3K27 sowie einer verminderten Azetylierung von H3 und H3K18 mit einer ungünstigen Prognose beim Nierenzellkarzinom, und in ähnlicher Weise beim Prostatakarzinom sowie bezüglich H3K4 und H4K20 beim Blasenkarzinom gefunden. Hinsichtlich der Histon-Varianten war beim primären Leberzellkarzinom H2A.1 überexprimiert während H2A.2 vermindert war. MacroH2a scheint das Wachstum von Melanomen zu unterdrücken. Beim Lungenkarzinom waren MacroH2A1.1 und MacroH2A2 bei schnell proliferierenden Tumoren unterexprimiert und korrelierten mit einem früherem Auftreten eines Tumorrezidivs.

Auch im Blut wurden Histonmodifikationen auf ihre Eignung als Biomarker für die Tumor-Diagnostik untersucht. Die erste methodische Studie hierzu erschien 2008, bei der die Histon-Markierung H3K9me1 auf im Plasma zirkulierenden Nukleosomen mittels ChIP detektiert und die assoziierte DNA anhand einer real-time PCR für perizentrische repetitive Sequenzen quantifiziert wurde. In weiteren Untersuchungen fanden sich erhöhte Konzentrationen an DNA von H3K9me3 und H4K20me3 bei Patienten mit Multiplem Myelom, während die Werte bei Patienten mit kolorektalem Karzinom erniedrigt waren (Abb. 2).

Zudem waren die Werte für H3K27me3 bei Patienten mit metastasiertem Prostatakarzinom vermindert. Die Ergebnisse für das kolorektale Karzinom wurden kürzlich in einer unabhängigen Patientenkohorte bestätigt. Im Gegensatz dazu waren bei Patientinnen mit Mammakarzinom die H3K9me3- (Abb. 2) und H4K20me3-Marker deutlich erhöht. Allerdings beruhen die Ergebnisse dieser Studien auf geringen Patientenzahlen und müssen durch weitere prospektive Untersuchungen validiert werden.

Fazit

Nachdem sich zirkulierende Nukleosomen in zahlreichen Studien als wertvolle Marker zur Prognoseabschätzung und zur frühzeitigen Beurteilung des Ansprechens einer zytotoxischen Therapie erwiesen haben, ist anzunehmen, dass hier – und im Therapiemonitoring – die zukünftigen Indikationsfelder für Histon-Modifikationen im Blut liegen werden. Durch die Quantifizierung geeigneter Muster von Tumor-assoziierten Histon-Modifikationen ist eine weitere Verbesserung der Aussagekraft im Vergleich zur unspezifischeren Gesamt-Nukleosomen-Konzentration zu erwarten.

Zudem sind einige Histon-Deazetylase-Inhibitoren bereits zur Behandlung von kutanen T-Zell Leukämien zugelassen, weitere befinden sich zur Behandlung diverser Tumorarten in der klinischen Prüfung. Für diese bieten sich die entsprechenden Histon-Modifikationen als Biomarker ideal zur Verlaufskontrolle an.

Schließlich sind derzeit eine Reihe von robusten, immunologischen Testverfahren für die Quantifizierung von Histon-Modifikationen und -Varianten in der Entwicklung, was zukünftige qualitätskontrollierte Messungen erleichtern wird. So wird sich in absehbarer Zeit erweisen, welchen Stellenwert die neue Klasse der zirkulierenden Nukleosomenmarker für Diagnose und Management von Tumorerkrankungen einnehmen wird.

 

Literatur

[1] J. Füllgrabe, N. Hajji, B. Joseph, Cell Death Differ. 2010, 17(8):1238-43.

[2] G. Leszinski, U. Gezer, B. Siegele, O. Stoetzer, S. Holdenrieder, Anticancer Res. 2012, 32(5):2199-205.

 

Korrespondenzadresse

PD Dr. med. Stefan Holdenrieder
Institut für Klinische Chemie und Klinische Pharmakologie, Universitätsklinikum Bonn
Sigmund-Freud-Str. 25, 53105 Bonn
Tel: +49(0)-228-287-12126

stefan.holdenrieder[at]uni-bonn.de

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Heft 2/2012

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