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mRNAseq eröffnet neue Einblicke in die AML

Die RNA-Sequenzierung kann bei der individuellen Verlaufsbeobachtung von Patienten mit der genetisch hochgradig heterogenen akuten myeloischen Leukämie (AML) helfen.

Beim Vergleich der somatischen Mutationen im Transkriptom von Blasten aus dem Knochenmark einer AML-Patientin mit der Sequenz von Knochenmarkproben, in denen nach Chemotherapie kein Krebs detektiert werden konnte, identifizierten Greif et al. mit Hilfe des Next-Generation-Sequencing fünf nicht-synonyme tumorspezifische somatische Mutationen. Neben bekannten Onkogenen wie RUNX1, fanden die Gruppen vom Klinikum Großhadern und dem Helmholtz-Zentrum München auch bisher unbekannte aktivierende Mutationen, zum Beispiel in TLE4 und SHKBP1. Das Sequenzierungsverfahren eröffnet durch die Identifizierung krebsspezifischer Mutationen die Möglichkeit, Patienten-spezifische MRD (minimal residual disease)-Verfahren zu etablieren und damit schneller Rückfälle zu erkennen. 

LABORWELT:

Was war das Ziel Ihrer Arbeit?


Bohlander:

Wir haben mit Hilfe des Next Generation Sequencing nach Mutationen in den aktiv transkribierten Genen einer Patientin mit akuter myeloischer Leukämie (AML) gesucht. AML ist genetisch sehr heterogen. Die ungefähr 50% der AMLs, bei denen man keine chromosomalen Auffälligkeiten findet, werden durch Punktmutationen verursacht, die zu mehr als 80% bis 90% unbekannt sind. Auch in den AMLs mit bekannten balancierten Translokationen ist das Mutationsspektum noch nicht genau bekannt. Deshalb haben wir die transkribierten Gene mit Hochdurchsatz-Sequenzierung nach aktivierenden onkogenen Mutationen durchgemustert. Unsere Überlegung war dabei: Gene, die mutiert sind und durch diese Mutation zu Onkogenen werden, müssen exprimiert werden. Um solche Mutationen zu identifizieren, muss man vom gleichen Patienten ein Transkriptom von Normalgewebe mit ähnlichem Expressionsmuster wie dem der malignen Zelle sequenzieren. Deshalb haben wir von derselben AML-Patientin RNA aus dem Knochenmark in Remission untersucht. Der Vorteil der Identifikation aktivierender Mutationen besteht darin, dass diese bessere therapeutischeTargets sind als Tumorsuppressorgene.

LABORWELT:

Das heißt, die Methode ist mit Blick auf die Klinik entwickelt worden?

Bohlander:

Es muss betont werden, dass es immer ein sehr langer Weg ist von der Mutationsanalyse zum Verständnis der Krankheit, und noch länger dauert, bis eine spezifische Therapie entwickelt ist. Von der Entdeckung des Philadelphia-Chromomindestenssoms bis zur Zulassung von Imatinib hat es zum Beispiel ganze 40 Jahre gedauert. Der schnellste klinische Tunraround wird sein, dass man mit der Transkriptom-Sequenzierungsmethode Mutationen findet, die sich als MRD-Marker eignen, also als Verlaufsmarker, die mit dem Wiederauftauchen eines Leukämieklons verbunden sind. Diese Verlaufsbeobachtung wird durch die Identifikation von Mutationen unmittelbar erleichtert. Da sich für jeden Patienten individuelle Marker identifizieren lassen, handelt es sich hier um eine sehr personalisierte Medizin.

LABORWELT:

Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse?

Bohlander:

Die Anzahl der Mutationen hält sich in Grenzen. Wir haben fünf gefunden. Das Überraschende war, dass man, wenn man nach missense- oder nonsense-Mutationen sucht, bei AML relativ wenige Mutationen dieser Art findet. Und diese Mutationen haben direkte funktionelle Auswirkungen. Bei Brustkrebs haben Arbeitsgruppen am Sanger-Center zum Beispiel -zig mutierte Gene gefunden. Bei soliden Tumoren ist es somit viel schwieriger, die funktionell relevanten Mutationen zu identifizieren. Allerdings sehen wir in verschiedenen AML-Patienten auch ganz unterschiedliche Mutationen, jeder hat also seine ganz individuelle Leukämie.

LABORWELT:

Was heißt das für die Zukunft?

Bohlander:

Letztendlich läuft es darauf hinaus, dass man bei jedem Tumor das ganze Genom sequenziert. Im Moment reduziert sich durch die Fokussierung auf ausschließlich aktiv transkribierte Bereiche das erforderliche Sequenzierungvolumen um mindestens den Faktor 20. Das wird auch in einen bezahlbaren Bereich kommen – vielleicht nicht übernächstes Jahr, aber in fünf Jahren. Was man aktuell schon vertreten könnte für insgesamt rund 2.000 Euro, wäre eine Gesamtexom-Sequenzierung, wobei ca. 50 Mbp an Sequenzen gecaptured werden müssen, die auf einer Spur eines Illumina GA-II sequenziert werden können. Die gesamte gesamte konventionelle Diagnostik einer AML kostet im Moment schon zwischen 1.000 und 2.000 Euro, das heißt, wenn das
Exom noch dazusequenziert würde, wäre das keine Verzehnfachung, sondern lediglich eine Verdoppelung der Kosten. Das geht schon in den Bereich des Machbaren. Erstattet werden die Kosten des Next Generation Sequencing von den Krankenkassen im Moment noch nicht. Wenn man allerdings bedenkt, dass im Moment die Sanger-Sequenzierung von einem einzigen Gen wie etwa BRCA1 mit bis zu 2.000 Euro erstattet wird und man mit der gleichen Summe schon jetzt alle Gene (ein Exom) sequenzieren kann, wird sich dies wohl bald ändern.
Künftig wollen wir das Next Generation Sequencing breiter einsetzen und eventuell sogar eine experimentelle Routinediagnostik daraus machen. Da es relativ schwierig ist, mit RNA zu arbeiten, fokussieren wir uns im Moment auf das Exon-Capturing.

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Heft 2/2011

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