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Blitzlicht

Die Regulation der kardialen Genexpression

Im Verlauf der embryonalen Entwicklung entsteht das Herz als erstes funktionsfähiges Organ. Damit dies fehlerfrei abläuft, müssen zahlreiche DNA-Transkriptionsfaktoren zum richtigen Zeitpunkt die richtigen Gene an- und abschalten können.

Die vier DNA-Transkriptionsfaktoren Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf spielen speziell für die Herzentwicklung eine enorm wichtige Rolle. Die Fähigkeit dieser Faktoren, an die DNA zu binden, ist dabei stark von der Zugänglichkeit des Chromatins abhängig. Epigenetische Mechanismen, wie die posttranslationalen Modifikationen von Histonen - kleine basische Proteine, um die die DNA gewickelt ist - beeinflussen diese Zugänglichkeit, indem sie die Struktur des Chromatins verändern und selbst Bindestellen für regulierende Transkriptionsfaktoren bereitstellen. Damit das Transkriptionsprodukt, die Proteine, im korrekten Mengenverhältnis vorliegen, bedarf es eines gewissen Maßes an Fine-Tuning in der Zelle.

In den vergangenen Jahren stellte sich heraus, dass microRNAs einen Teil dieser Aufgabe übernehmen. Diese kleinen, etwa 21 Basenpaar langen intrazellulären einzelsträngigen RNA-Moleküle regulieren die Transkriptionsmaschinerie, indem sie entweder die mRNA abbauen oder deren Translation verhindern. Viele bisherige Studien untersuchten die verschiedenen Mechanismen zur Regulation der Transkription im Detail; doch nur wenig ist darüber bekannt, wie stark diese Mechanismen zusammenarbeiten.

Das Ziel unserer Arbeit war es, herauszufinden, wie die verschiedenen genetischen, epigenetischen und posttranskriptionellen Ebenen der herzspezifischen Genregulation miteinander verknüpft sind.Im ersten Schritt untersuchten wir direkte Zielgene der herzspezifischen Transkriptionsfaktoren Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf in der Herzmuskelzelllinie HL-1 mittels Chromatin-Immunopräzipitation und anschließender Array-Analyse (ChIP-chip). Dabei konnten mehrere hundert DNA-Bindestellen für jeden Transkriptionsfaktor identifiziert werden, die überwiegend in regulatorischen Bereichen herz- und muskelspezifischer Gene liegen. Allein Srf bindet an mehr als 1.300 verschiedenen Stellen der DNA und kann die Ableserate von mehr als 1.000 Genen beeinflussen. Es ist bekannt, dass Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf miteinander interagieren können und auch gemeinsam regulierte Gene besitzen.

Jedoch war bisher unklar, wie oft solch eine gemeinsame Regulation von Zielgenen stattfindet. Unsere Untersuchung von gemeinsamen DNA-Bindestellen ergab, dass Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf sehr oft an ein- und dieselben Zielgene binden. Allein 91 Zielgene werden von allen vier Transkriptionsfaktoren gebunden. Dies deutet darauf hin, dass bei der Regulation von Herz- und Muskelgenen ein komplexes Zusammenspiel der Transkriptionsfaktoren stattfindet.

Die Bindung eines Transkriptionsfaktors an ein Zielgen lässt jedoch noch keine Rückschlüsse über dessen Einfluss und vor allem die Art der funktionellen Regulation zu, also ob ein Gen an- oder abgeschaltet wird. Aus diesem Grund untersuchten wir im nächsten Schritt die funktionellen Konsequenzen des Knock-downs der einzelnen Transkriptionsfaktoren mittels siRNA-Technik, die zu einer signifikanten Reduktion der Expression auch auf Proteinebene führte. Die daraus resultierenden Effekte auf mRNA-Ebene wurden mit genomweiten Expressions-Arrays gemessen.

Im Einklang mit einer überwiegend aktivierenden Funktion der untersuchten Transkriptionsfaktoren waren die meisten der deregulierten Gene inhibiert. Wie schon bei der Untersuchung von gemeinsamen DNA-Bindestellen stellte sich heraus, dass alle vier Transkriptionsfaktoren sich einen großen Teil der deregulierten Gene teilen. Interessanterweise waren genau die Gene, die von mehreren Transkriptionsfaktoren gebunden wurden, am seltensten im jeweiligen Knock-down dereguliert. Dies gibt uns einen Hinweis auf einen Puffereffekt durch kombinatorische Bindung an Zielgene. Dabei können Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf die Gen-expression auch beim Abhandenkomen oder Ausfall eines einzelnen Transkriptionsfaktors weiter aufrechterhalten. Für diesen Puffereffekt durch kombinatorische Bindung spricht zudem, dass nur ein geringer Teil der direkten Zielgene (ca. 10%) auch im jeweiligen Knock-down der Transkriptionsfaktoren dereguliert war. Hinzu kommt, dass Transkriptionsfaktoren, die viele gemeinsame Zielgene besitzen, nur eine geringe Menge an gemeinsamen deregulierten Genen aufwiesen und umgekehrt. 

Epigenetische Regulation

Um besser zu verstehen, inwieweit epi-genetische Regulationsmechanismen für die Genaktivität im Herzen eine Rolle spielen, untersuchten wir den Einfluss von vier aktivierenden Histon-Modifikationen: der Histon H3-Acetylierung (H3ac), Histon H4-Acetylierung (H4ac), Histon H3-Lysin 4-Dimethylierung (H3K4me2) und der Histon H3-Lysin 4-Trimethylierung (H3K4me3). Durch erneute ChIP-chip-Experimente wurde das gemeinsame Auftreten dieser Histon-Modifikationen und Transkriptionsfaktor-Bindestellen an Zielgenen analysiert. Mehr als 80% der identifizierten Transkriptionsfaktor-Bindestellen zeigten eine oder mehrere dieser Histon-Modifikationen. Schließlich untersuchten wir, ob das Auftreten von Histon-Modifikationen auch mit einer höheren Expression von direkten Zielgenen korreliert. Dabei zeigte sich, dass das aktivierende Potential von Gata4 und Srf auf die Expression ihrer Zielgene vom gleichzeitigen Auftreten von H3ac abhängt. Für Mef2a und Nkx2.5 konnte dieser Zusammenhang nicht gezeigt werden; ihre Zielgene sind unabhängig von einer Acetylierung von Histon 3 höher exprimiert als ungebundene Gene.

Epigenetische Regulation

Um besser zu verstehen, inwieweit epi-genetische Regulationsmechanismen für die Genaktivität im Herzen eine Rolle spielen, untersuchten wir den Einfluss von vier aktivierenden Histon-Modifikationen: der Histon H3-Acetylierung (H3ac), Histon H4-Acetylierung (H4ac), Histon H3-Lysin 4-Dimethylierung (H3K4me2) und der Histon H3-Lysin 4-Trimethylierung (H3K4me3).

Durch erneute ChIP-chip-Experimente wurde das gemeinsame Auftreten dieser Histon-Modifikationen und Transkriptionsfaktor-Bindestellen an Zielgenen analysiert. Mehr als 80% der identifizierten Transkriptionsfaktor-Bindestellen zeigten eine oder mehrere dieser Histon-Modifikationen. Schließlich untersuchten wir, ob das Auftreten von Histon-Modifikationen auch mit einer höheren Expression von direkten Zielgenen korreliert. Dabei zeigte sich, dass das aktivierende Potential von Gata4 und Srf auf die Expression ihrer Zielgene vom gleichzeitigen Auftreten von H3ac abhängt. Für Mef2a und Nkx2.5 konnte dieser Zusammenhang nicht gezeigt werden; ihre Zielgene sind unabhängig von einer Acetylierung von Histon 3 höher exprimiert als ungebundene Gene.

Weitergehende ChIP-Experimente mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung (ChIP-seq) für Srf und H3ac untermauerten die Ergebnisse und deuteten darüber hinaus einen Puffereffekt der H3ac auf die Expression von Srf-Zielgenen in dessen Knock-down an. Zur Bestätigung dieser Ergebnisse aus der Herzzelllinie, führten wir eine Zeitreihen-analyse in Mäuse-herzen verschiedener Entwicklungsstadien durch. Zusammengenommen zeigten unsere Ergebnisse den Einfluss des Zusammenspiels von H3ac und Srf auf die Genexpression während der Herzentwicklung. 

Posttranskriptionale Regulation

Abschließend wurde der Einfluss von micro-RNAs (miRNAs) als indirekte posttranskriptionelle Regulationsebene von kardialen Transkriptionsnetzwerken untersucht. Es ist bekannt, dass Srf für die Regulation von herzspezifischen miRNAs verantwortlich ist und auch selbst durch miRNAs reguliert wird10. Mit Hilfe unserer Daten identifizierten wir 22 miRNAs mit einer Srf-Bindestelle, darunter viele bereits bekannte Srf-regulierte mi-RNAs, wie miR-1 und miR-13310. Quantitative Sequenzierung von miRNAs (small RNA-seq) nach siRNA-vermitteltem Knock-down von Srf, ergab 42 differenziell exprimierte mi-RNAs, von denen 78% herunterreguliert waren (Abb. 3a). Durch miRNA-Bindestellenvorhersage in 3'UTR-Bereichen konnten 192 miRNA-Zielgene identifiziert werden, wovon 57% im Knock-down von Srf hochreguliert waren. Wie anfangs erwähnt, ist nur ein kleiner Teil von direkt gebunden Zielgenen auch gleichzeitig im Srf-Knock-down differenziell exprimiert. Unsere Untersuchung hinsichtlich des Einflusses von miRNAs ergab, dass bis zu 45% aller differenziell exprimiertenGene durch miRNAs erklärt werden können (Abb. 3b). Sie sind damit vielversprechende Kandidaten für die Regulation von indirekten Zielgenen.

Fazit

Unsere Analysen der Regulation kardialer Transkriptionsnetzwerke ergaben ein hohes Maß an Komplexität und Flexibilität, wobei die verschiedenen genetischen, epigentischen und post-transkriptionellen Regulationsebenen vielfach miteinander verknüpft sind und wechselwirken. Damit erweitern unsere Daten das Wissen über Genexpressionsregulation im Herzen und tragen ein weiteres Puzzleteil zum Verständnis genetisch bedingter Herzerkrankungen, wie zum Beispiel angeborene Herzfehler, bei.

Literatur:

[1] Molkentin, J.D., Lin, Q., Duncan, S.A. & Olson, E.N. (1997). Genes Dev 11: 1061-1072.

[2] Lyons, I., Parsons, L.M., Hartley, L. et al. (1995). Genes Dev 9: 1654-1666.

[3] Naya, F.J., Black, B.L., Wu, H. et al. (2002). Nat Med 8: 1303-1309.

[4] Niu, Z., Yu, W., Zhang, S.X. et al. (2005). The Journal of biological chemistry 280: 32531-32538.

[5] Kouzarides, T. (2007). Cell 128: 693-705.

[6] Sevignani, C., Calin, G.A., Siracusa, L.D. & Croce, C.M. (2006). Mamm Genome 17: 189-202.

[7] Schlesinger, J., Schueler, M., Grunert, M. et al. (2011). PLoS Genet 7: e1001313.

[8] Clark, K.L., Yutzey, K.E. & Benson, D.W. (2006). Annual Review of Physiology 68: 97-121.

[9] Akazawa, H. & Komuro, I. (2005). Pharmacology & therapeutics 107: 252-268.

[10] Chen, J.F., Mandel, E.M., Thomson, J.M. et al. (2006). Nat Genet 38: 228-233.

Diese Arbeit wurde finanziert durch das European Community's Sixth Framework Program (''HeartRepair'') LSHM-CT-2005-018630 und durch das Seven Framework Program (''CardioGeNet'') 2009-223463.

Korrespondenzadresse:

Prof. Dr. Silke R. Sperling

Max-Planck-Institut für molekulare Genetik AG

Kardiovaskuläre Genetik

Ihnestr. 73

14195 Berlin

sperling@molgen.mpg.de

www.molgen.mpg.de

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