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Zellspezifischer Knockdown von Zielgenen mit Intelligenter siRNA

Therapien auf Basis der RNA-Interferenz (RNAi) haben enormes Potential für die Behandlung derzeit nur unbefriedigend oder gar nicht therapierbarer Krankheiten. Allerdings steht die bisher unzureichende Zellspezifität der small interferring RNAs (siRNAs) ihrer breiten therapeutischen Anwendung im Wege.

Die von uns entwickelte Technologie der „Intelligenten siRNA“ bietet einen innovativen Lösungsansatz. Dabei werden herkömmliche siRNA-Moleküle mit einem Schlüssel-Schloss-Prinzip ausgestattet. Ausschließlich in den Zielzellen befindet sich der Schlüssel, und die siRNA wird nur dort aktiv. Durch die damit erreichte Zielzellspezifität kann siRNA erstmals auch als reines Toxin für Tumorzellen verwendet werden.

Derzeit bauen wir unsere Plattformtechnologie zum zielzellspezifischen  Stummschalten von Genen an der Friedrich-Schiller-Universität Jena aus. Die Technologie beruht auf der RNAInterferenz, kurz RNAi. Unter RNAi versteht man einen Mechanismus in Zellen, mit dem durch Wechselwirkung von kurzen, interferierenden RNA-Molekülen (engl. short interferring RNA: kurz siRNA) mit der mRNA einzelner Gene ein Enzymkomplex aktiviert wird, durch den genau diese mRNA abgebaut wird. Dadurch wird die Expression von Proteinen verhindert, ohne die Erbinformation der Zellen zu beeinflussen. Die US-Wissenschaftler Fire und Mello erhielten für diese Entdeckung 2006 den Nobelpreis für Medizin. Seither ist das Interesse an RNAi explosionsartig gestiegen, denn die Nutzung des Mechanismus in den Biowissenschaften und der Pharmaforschung eröffnet völlig neuartige Anwendungen und Therapieperspektiven.

In den Biowissenschaften wird der Mechanismus genutzt, um die Expression von Genen und damit die Produktion von Proteinen in der Zelle in vitro und in vivo zu unterdrücken. Besonders im therapeutischen Bereich haben siRNA-Moleküle ein großes Potential. Sie beeinflussen nicht das gesamte Genom und sind sowohl einfach handhabbar, synthetisch herstellbar als auch hocheffektiv. Im Labor konnte bereits gezeigt werden, dass sich Tumorzellen nach Behandlung mit bestimmten siRNA-Molekülen langsamer teilen und weniger invasiv wachsen. Dies beflügelt die Erforschung neuer Therapieformen auf RNAi-Basis und gibt Patienten mit Tumoren, die bisher nicht oder nur unzureichend therapierbar waren, neue Hoffnung.

Auch für die Behandlung von Virusinfektionen stellt die Therapie auf siRNA-Basis ein vielversprechendes Konzept dar. Ein gutes Dutzend Firmen arbeitet bereits an der therapeutischen Umsetzung dieser Idee. Allerdings stoßen alle Forschungsbemühungen für den therapeutischen Einsatz von siRNA auf das gleiche Problem: siRNA-Moleküle wirken per se nicht zielzellspezifisch. Daher wurden bereits Strategien zur Modifikation von siRNA-Molekülen entwickelt, die eine Zellspezifität vermitteln sollen – allerdings bisher mit eher mäßigem Erfolg.

Intelligente siRNA

An diesem Punkt setzt nun die Innovation der „Intelligenten siRNA“ an. Unser Forscherteam verfolgt die neue Strategie, siRNA-Moleküle zunächst zu inhibieren und unter Anwendung des Schlüssel-Schloss-Prinzips nach Transporter-vermitteltem Import (Polytheylenimine oder Nanocarrier) ausschließlich in den Zielzellen aktiv werden zu lassen. Spezifische Peptide, die an die siRNA gebunden werden, unterbinden zunächst – ähnlich wie Handschellen – die biologische Aktivität der siRNA. Die gebundenen Peptide enthalten jedoch nahe der Bindungsstelle für siRNAs Zielsequenzen für Peptidasen, die nur in den Zielzellen in aktiver Form vorhanden sind. Diese Peptidasen sind der Schlüssel für die Handschellen, sie spalten die hemmenden Peptide ab und reaktivieren dadurch die siRNA. In Nicht-Zielzellen kommen die spezifischen Peptidasen nicht vor, die „Intelligente siRNA“ verbleibt dort inaktiv (Abb. 1). Aufgrund der chemischen Struktur der siRNA können bis zu vier verschiedene Peptide, spezifisch für vier verschiedene Peptidase   gebunden werden. Hierdurch kann die Spezifität enorm erhöht werden, denn die siRNA wird erst dann aktiv, wenn in den Zielzellen alle vier Peptidasen vorhanden sind. Durch den beschriebenen Mechanismus werden somit an eine herkömmliche siRNA bis zu vier spezifische „Schlösser“ angefügt, die durch vier verschiedene „Schlüssel“ (Peptidasen) geöffnet werden können. Wir haben diese peptidgebundene siRNA „Intelligente siRNA“ genannt, da sie zu „wissen“ scheint, in welchen Zellen sie wirken soll – vor allem aber, in welchen Zellen sie nicht zur Wirkung kommen darf. Die damit erreichte Zellspezifität wird dieser Technologie den Weg für die therapeutische Anwendung von siRNA ebnen.

Therapeutische Anwendungsfelder

Besonders attraktiv ist die Technologie zur Behandlung von Tumoren und Virusinfektionen. Durch die Möglichkeit, ganz spezifisch bestimmte Zellen mit siRNA beeinflussen zu können, kann siRNA erstmals auch zum therapeutisch erwünschten selektiven Abtöten von Zellen benutzt werden. Dazu entwickelt unser Team derzeit eine „Intelligente siRNA“, welche zellspezifisch sogenannte Off-Target- Effekte auslöst und damit die Zielzellen so stresst, dass diese abstirbt. Damit wird siRNA nicht mehr nur zum „Stummschalten“ von Genen, sondern als zellspezifisches Toxin für Tumorzellen verwendet.

Weiteren Wert könnte die „Intelligente siRNA“ bei der Behandlung von Virusinfektionen zeigen. Während aktuelle Strategien oft Virus-Protease-Inhibitoren einsetzen und Mutationen der Viren zu Resistenzen gegen das Medikament führen, würde der kombinatorische Einsatz dieser Inhibitoren zusammen mit „Intelligenter siRNA“ genau die Vermehrung dieser „Escape“-Mutationen verhindern (Abb. 2).

Dabei würde:

  1. die entsprechende Virus-eigene Protease entweder durch den eingesetzten Protease- Inhibitor gehemmt und das Virus kann sich nicht replizieren oder würde
  2. bei einer Escape-Mutation die entsprechende Protease wieder aktiv, was dann aber zur Aktivierung einer „Intelligenten siRNA“ führt. Diese aktivierte siRNA tötet dann die Wirtszelle zusammen mit dem Virus ab. Damit ist ein zweiter Verteidigungswall zur Verhinderung dieser Mutationen geschaffen, und die Wirksamkeit etablierter Medikamente kann langfristig erhalten werden. Da die siRNA erst aktiviert wird, wenn Escape-Mutanten gegen den Protease-Inhibitor entst  den sind, wird außerdem die Resistenzbildung gegen die siRNA extrem erschwert.

Ausblick

Wie soll die Entwicklung „Intelligenter siRNA“ weitergehen? Wir möchten die Technologie für zahlreiche weitere Anwendungen etablieren. Zum Einen ist unsere Technologie für den pharmazeutischen Markt interessant, aber auch Grundlagenwissenschaftler können von der Verwendung „Intelligenter siRNA“ profitieren. Beispielsweise ließen sich bestimmte Gene ganz gezielt in einer Zellpopulation innerhalb eines Zellgemisches ausschalten, beispielsweise in T-Zellen im Gemisch von Immunzellen. Hier besteht ein enormes Einsparpotential an Zeit und Kosten. Zum Anderen könnte man in Versuchstieren, beispielsweise Mäusen, organspezifisch Gene ausschalten. Dies ist zwar technologisch auch heute schon möglich, dazu ist aber neben hohen Investitionen und einem hohen Zeitaufwand vor allem eine große Anzahl von Versuchstieren notwendig, um entsprechende Mausstämme zu züchten.

Durch den Einsatz „Intelligenter siRNA“ ließe sich hier der Einsatz von Versuchstieren drastisch reduzieren. Für die erwähnten Anwendungen entwickeln wir akt  ll Kits für den Forschungsmarkt, mit denen solche zellspezifische Anwendungen ermöglicht werden. Für therapeutische Anwendungen wird derzeit eine „Intelligente siRNA“ entwickelt, die für Mammakarzinom-Zellen spezifisch ist. Erste in vivo-Studien zeigten eine hohe Wirksamkeit und eine gute Verträglichkeit der „Intelligenten siRNA“-Moleküle. Für die nächsten Schritte – die abschließende Kandidatenfindung und die Durchführung präklinischer Studien – wurde eine Förderung im Rahmen des GoBio-Programmes des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) beantragt; für die Kommerzialisierung der Technologie auf dem Forschungsmarkt ist die Gründung der Firma „BianoScience“ (www.Biano Science.com) im Mai diesen Jahres geplant.

Die derzeitigen Entwicklungen wurden durch das EXIST-Forschungstransfer- Programm des Bundesministeriums für Wirtschaft und Technologie (BMWi) unterstützt und im Rahmen eines Gründungsprojektes durchgeführt. Wir haben unsere Forschungstätigkeiten bereits frühzeitig auf eine Vermarktung der  Resultate ausgerichtet. Dies ist auch ein Grund dafür, weshalb bereits sechs Patente angemeldet wurden, eines davon ist in der EU bereits erteilt. Ein Businessplan und eine Marktstrategie für die Kommerzialisierung der  Technologie sind bereits erstellt. Bei den therapeutischen Anwendungen der Technologie wird auch der Kontakt zu Pharmaunternehmen notwendig, die zum einen die Kompetenzen zur Durchführung von klinischen Studien und die benötigten finanziellen Ressourcen mitbringen, zum anderen aber auch über Marktzugänge verfügen und in der Lage sind, entsprechende Produkte Ärzten und Patienten zugänglich zu machen. Unsere Vision ist, dass sich "Intelligente siRNA" im Pharmamarkt und im grundlagenwissenschaftlichen Markt zu einer Schlüsseltechnologie entwickelt.

Korrespondenzadresse:

Dr. Tobias Pöhlmann
Gründungsprojekt "Intelligente siRNA" Universitätsklinikum Jena Friedrich-Schiller-Universität Jena

Kahlaische Straße 1
07743 Jena

Tel./ Fax: +49-(0)3641-930850/-930852

Tobias.Poehlmann[at]Intelligent-siRNA.com

www.intelligent-sirna.com

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Heft 2/2011

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