Genomsequenzierung von Prostatatumoren

Next Generation Sequencing (NGS)-Technologien machen Sequenzierungen vollständiger Genome seit kurzem technisch und finanziell in großem Umfang möglich. Die ersten NGS-Studien an Lungen- und Prostatatumoren zeigen, dass viele genetische Aberrationen mit herkömmlichen Methoden bisher nicht identifiziert wurden. Aufgrund ihrer Heterogenität muss eine Vielzahl von Tumorgenomen analysiert werden, damit zuverlässige Ergebnisse erhalten werden. Um Mutationen zu identifizieren, die in mindestens 3 % einer Tumorentität auftreten, ist zum Beispiel die Sequenzierung von 500 Genomen dieser Entität nötig.

Ein Vorhaben dieser Größenordnung ist nur durch die interdisziplinäre Zusammenarbeit von führenden Wissenschaftlern der verschiedensten Fachrichtungen - wie etwa von Ärzten, Biologen und Informatikern - auf internationaler Ebene durchführbar. Vor diesem Hintergrund wurde im Oktober 2007 das International Cancer Genome Consortium (ICGC; www.icgc.org) ins Leben gerufen. Dieses Konsortium hat das ehrgeizige Ziel, die Genome, die transkriptionellen Veränderungen und epigenetische Marker von 50 Tumorentitäten mit weltweit klinischer und gesellschaftlicher Bedeutung vollständig zu katalogisieren. Dazu zählen neben Prostata- auch Lungen-, Kolon- und Brusttumoren, an denen weltweit jährlich nahezu drei Millionen Menschen versterben. Der Zusammenschluss zu einem internationalen Konsortium ermöglicht ein koordiniertes und standardisiertes Vorgehen der Projektpartner, so dass technische und finanzielle Ressourcen optimal genutzt, hohe und einheitliche Qualitätsstandards durchgesetzt und keine redundanten Fragestellungen bearbeitet werden.

Das Know-how der einzelnen Projektpartner, beispielsweise im Bereich der Datenintegration, kann effizient verbreitet und gemeinsam genutzt werden. Ein standardisiertes Vorgehen gewährleistet auch die Vergleichbarkeit der Daten für weiterführende Analysen. Ein wichtiges Anliegen des ICGC ist es, die Ergebnisse schnellstmöglich der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung zu stellen, um die Tumorforschung voranzubringen und die Resultate in die klinische Anwendung zu überführen. Derzeit sind im ICGC 35 Projekte aus 12 Ländern vertreten, die Tumoren aus 17 verschiedenen Organen sequenzieren (Abb. 1). Deutschland ist mit drei Projekten vertreten, der Sequenzierung kindlicher Hirntumoren, maligner Lymphome und früh auftretender Prostatakarzinome.

Fokus auf Prostatakarzinome des frühen Alters

Obwohl das Prostatakarzinom ein Tumor älterer Männer ist, tritt er bei einigen Patienten bereits im Alter von 50 Jahren oder früher auf. Wir widmen uns seit November 2010 im Projekt "The genomes of early onset prostate cancer" genau diesen frühen Tumoren, da ihnen möglicherweise eine Schlüsselrolle im Verständnis der Biologie des Prostatakarzinoms zukommt:

• Sie tragen wahrscheinlich eine geringere Zahl nicht-tumorassoziierter (passenger) Aberrationen, so dass hier eine höhere Wahrscheinlichkeit besteht, Treibermutationen zu identifizieren.
• Sie besitzen Veränderungen, die möglicherweise für die frühe Diagnose klassischer Prostatakarzinome nützlich sind.
• Ihre molekularen Veränderungen können zur Entwicklung neuer zielgerichteter Therapeutika genutzt werden, die insbesondere wichtig für die jüngeren Patienten sind.
• Sie weisen möglicherweise erbliche Aberrationen auf und können durch den Vergleich mit Prostatakarzinomen klassischer Altersstruktur Hinweise auf die Entstehung hereditärer Prostatakarzinome liefern. 

In dem interdisziplinären Projekt arbeiten eine Reihe von Gruppen zusammen, die Expertisen im Bereich der Bearbeitung humaner Gewebeproben, der Sequenzierung und der bioinformatischen Datenauswertung besitzen sowie über umfassende technische Ressourcen für die Sequenzierung verfügen (Abb. 2). Innerhalb der nächsten fünf Jahre sollen die Genome, Methylome und Transkriptome von 250 chirurgisch entfernten Prostatakarzinomen sequenziert werden. Zur Korrektur erblicher Veränderungen werden die genomischen Sequenzdaten mit denen autologer Blutzellen verglichen. Ein eigens für dieses Projekt entwickeltes Dissektionsschema erlaubt die Kryokonservierung der gesamten Prostata und gewährleistet eine differenzierte histologische Begutachtung und Arealauswahl. Aus einem der insgesamt etwa 100 Areale, das (ggf. nach Makro- bzw. Mikrodissektion) mindestens 60% viable Tumorzellen enthält, können die für die verschiedenen Sequenzierungen nötigen Mengen von etwa 25 µg hochmolekularer DNA und ca. 10 µg intakter RNA gewonnen werden.

Für die Genomsequenzierung werden mittels mate pair- bzw. paired end-Sequenzierung unter Verwendung verschiedener Insertgrößen sowohl kleine DNA-Aberrationen als auch größere strukturelle Veränderungen detektiert. Um zwischen echten Mutationen und Polymorphismen bzw. Sequenzierfehlern zu unterscheiden, ist eine mindestens 30-fache Abdeckung des Genoms notwendig. Parallel dazu werden an denselben Tumorproben und nicht malignem Prostatagewebe als Referenz Methylom-, mRNAom- und smallRNAom-Sequenzierungen vorgenommen. Da eine komplette Sequenzierung bisulfitkonvertierter DNA noch zu kostenintensiv ist, wird die methylierte DNA mittels Methyl-CpG-Immunpräzipitation angereichert und anschließend sequenziert. Mit diesem Vorgehen können wir neben Veränderungen auf DNA-Ebene auch differenzielle Methylierung und deregulierte Expression nachweisen und zudem neue Transkripte oder transkribierte Fusionsgene detektieren. Integrative Datenanalysen werden die Zusammenhänge der einzelnen Ebenen offenlegen und etwa Informationen zur allelspezifischen Genexpression liefern. Für die Sequenzierungen werden die Life Technologies (SOLiD) und Illumina (Genome Analyzer)-Technologie verwendet. Da diese ständig weiterentwickelt werden, unterliegt auch die Probenbearbeitung und Sequenzierung während des gesamten Projekts einer ständigen Optimierung.

Das Management der großen Datenmengen sowie ihre bioinformatische Auswertung stellen die Informatiker vor neue Herausforderungen. Allein ein einzelnes Genom benötigt einen Speicherplatz von mindestens 400 GByte. Hierfür wurde am BioQuant-Zentrum der Universität Heidelberg eines der größten Datenspeicherzentren in ganz Europa mit mehr als 5 PByte Speicherkapazität angelegt. Zudem wird im ICGC ein Franchise-Datenbanksystem genutzt, wobei jedes ICGC-Projekt Informationen wie Qualitätsparameter, klinische Daten und die Ergebnisse der Sequenzierungen in einer eigenen solchen Datenbank speichert. Datenabfragen erfolgen über eine zentrale Eingabemaske des ICGC.

Die enge Zusammenarbeit und ständige Kommunikation mit anderen Arbeitsgruppen in den USA und Kanada, die Prostatakarzinome klassischer Altersstruktur sequenzieren, fördert effiziente Problemlösungen und Datenvergleiche.

Insgesamt wird das ICGC in den nächsten Jahren neben fundamentalen Erkenntnissen in der Tumorbiologie auch neue methodische Entwicklungen liefern. Die Ergebnisse bilden eine wichtige Basis für die weitere Erforschung der Tumorursachen und werden auch neue diagnostische und therapeutische Optionen aufzeigen. Wahrscheinlich legt das ICGC damit den Grundstein für den bisher größten Schritt zur personalisierten Medizin.

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