Thema:

Automation

Automation der Zielgen-Anreicherung für den GS FLX

Die Standardisierung und Automatisierung der Probenvorbereitung für das Next-Generation-Sequencing ist die Voraussetzung für die Erhebung in sich konsistenter Daten im Rahmen genomweiter Sequenzierungsstudien. Die Kombination zweier Mikrofluidik-Workstationen reduziert die Zeit der Probenvorbereitung für die Sequenzierung auf dem Genome Sequencer FLX (454 Life Sciences/Roche Applied Science) von 5 Stunden auf 15 Minuten. 

Die Genome Sequencer FLX (GS FLX)-Plattform (Roche Applied Science, Penzberg) bietet Vorteile bei der de novo-Sequenzierung und -Assemblierung genomischer DNA, beim Transkriptom- und Amplicon-Sequencing sowie bei der Analyse kleiner RNAs. Der Arbeitsablauf auf dem GS FLX System besteht aus vier Schritten: Dem Erzeugen der Sequenzbibliothek, der klonalen Sequenz-Amplifikation mittels Emulsions-PCR, der Sequenzierung selbst und der bioinformatischen Datenauswertung. 

Roches REM e System ermöglicht eine vollständige Automatisierung der Sequenzamplifikation und des Annealings der Sequenzprimer im Rahmen der Emulsions-PCR mit GS FLX Titanium-Reagenzien (vgl. Abb. 2). Gegenüber der manuellen Probenvorbereitung vereinfacht die Kombination einer Liquid Handling-Plattform mit dem REM e System die Durchführung der Emulsions-PCR signifikant: Fünf Stunden manuelle Laborarbeit werden durch einen reproduzierbaren, vollautomatischen Prozess ersetzt. 

Insgesamt stehen nach Positionierung des REM e Moduls auf der Arbeitsfläche des Microlab® Starlet Liquid Handling-Systems fünf verschiedene, vollautomatisierte REM e-Protokolle zur Verfügung, mit denen bis zu acht Proben parallel bearbeitet werden können. 

Das REM e Modul übernimmt dabei das Vortexen, die Vakuumfiltration, den Sequenz-Capture-Schritt mit Magnetbeads und das Erhitzen. Das Microlab® Starlet System führt alle Flüssigkeitstransfer mit Hilfe seiner voneinander unabhängigen 1.000 µl-Pipettierkanäle durch.

In einer Testserie wurde ermittelt, ob die Integration des REM e Systems in die Microlab® Starlet Liquid Handling Workstation zu vergleichbaren Anreicherungsergebnissen führt wie die für Pipettierfehler anfälligere und wesentlich langsamere manuelle Probenvorbereitung.

Methoden

Das hier eingesetzte Microlab® Starlet Liquid Handling System war mit folgenden Komponenten ausgestattet:

l autonome 1000 µl Pipettierkanäle (Hamilton)

l REM e System (454 Life Sciences)

l REM e System Tube Rack Carrier (Hamilton)

l REM e System Deck Module Carrier (Hamilton)

l 3 x 120 ml Reagent Carrier (Hamilton)

l 120 ml Reagent Trough (Hamilton)

l Tip Carrier (Hamilton)

l 1000 µl CO-RE-Einmalpipettenspitzen (Hamilton).

Das REM e System wurde gemäß Herstellervorgaben installiert und die „Large Volume 4 Emulsion Cups per Run“-Methode mit Hilfe der Hamilton-Software Vector 4.2.0.6425 programmiert. Emulsions-PCR-Amplifikationsansätze wurden für vier zuvor generierte GS FLX Titanium Rapid Libraries gemäß Herstellerangaben angesetzt. 

Nach Amplifikation mit der emPCR-Methode für große Volumina (LV) wurde die Wasser-Öl-Emulsion aufgebrochen (gemäß Manual: bis Schritt 13/Abschnitt 3.5.3.), die Beads jeder LV-Probe in einem konischen 50 ml-Röhrchen vereint und mit Enhancing Fluid XT des emPCR Kits auf 5 ml aufgefüllt. 

Die Proben wurden dann gemäß REM e System-anleitung auf dem Hamilton Microlab® Starlet plaziert und vier Emulsions-Cups prozessiert, wie im REM e System-Protokoll beschrieben.

Ergebnisse

Nach Anreicherung mittels des REM e Systems wurden die Beads durchflusszytometrisch gemäß Herstellerangaben gezählt. Dabei wurde bei allen vier Proben die gewünschte Anreicherung um 5 % bis 20 % erzielt (vgl. Tab. 1). Die Beads wurden unter Einsatz einer in vier Bereiche unterteilten Picotiterplatte sequenziert. 

Sowohl die Sequenzanreicherung (Tab. 1) als auch die mittleren Leselängen (mit rund 400 Basen) lagen im Zielbereich. Damit liefert die Automation der Probenvorbereitung mit Hilfe der Microlab® Starlet Liquid Handling Workstation qualitativ hochwertige Sequenzierergebnisse bei signifikanter Reduktion der Hands-on-Zeit und des Risikos für Pipettierfehler. Das hier vorgestellte System ist geeignet für alle Typen von GS FLX-Titanium-Bibliotheken – wie Shotgun-, Paired End-, cDNA- und Amplicon-Libraries mit oder ohne Multiplex Identifiern (MIDs) – sowie für Emulsions-PCR-Formate mit kleinen, mittleren und großen Volumina. 

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Heft 1/2012

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