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In-vitro-Diagnostik

SteroIDQ® Kit setzt neue Maßstäbe in der Steroidhormonanalyse

Die meisten derzeit in der Steroidhormonanalytik eingesetzten Methoden basieren auf Immunoassays, die einerseits sensitiv, rasch und kostengünstig durchführbar sind, andererseits ist deren Selektivität aber nicht in allen Fällen gänzlich zufriedenstellend. Daher kommen immer häufiger massenspektrometrisch basierte analytische Verfahren zur Anwendung, die neben ihrer hohen Selektivität den Vorteil haben, aus einer einzigen biologischen Probe zahlreiche Analyten simultan quantifizieren zu können.

Seit kurzem ist mit dem SteroIDQ® Kit das erste gebrauchsfertige und CE-gekennzeichnete In-vitro-Diagnostikum zur simultanen Bestimmung von 16 Steroidhormonen aus einer einzigen Serumprobe auf dem Markt verfügbar. Mit SteroIDQ® können Störungen in der Steroid-hormon-Biosynthese nicht nur mehr anhand eines einzelnen Steroidhormons, sondern anhand eines umfassenden Steroidprofils nachgewiesen werden.

Steroidhormonbestimmung: Stand der analytischen Technik

Immunoassays: Unsere Kenntnis der physiologischen Rolle von Steroidhormonen verdanken wir größtenteils Studienergebnissen, die mittels dem Radioimmunoassay-Verfahren (RIA) erhoben wurden1. Diese Methode ist bei entsprechender Validierung zwar höchst sensitiv und zuverlässig, wird aber aufgrund ihrer Komplexität, hohen Kosten und besonders durch die radioaktiv basierte Analyse heutzutage ungern eingesetzt. Daher kommen seit den späten 1970er Jahren hauptsächlich direkte Immunoassays zur Anwendung, die einfach in der Handhabung und kostengünstig sind, allerdings ebenfalls nennenswerte Nachteile aufweisen, wie Limitation in der Selektivität durch Kreuzreaktivitäten mit strukturverwandten Metaboliten, Limitationen in der Sensitivität, Matrixeffekte, welche nicht durch interne Standards korrigiert werden und relativ hohe Variabilitäten zwischen den verschiedenen Immunoassay Kits1-3. Schließlich ist bei Einsatz eines Immuno-assays die Bestimmung nur eines Analyten möglich. Die separate Messung mehrerer Hormone erfordert dementsprechend mehrere Probenaliquote und somit eine größere Probengesamtmenge, was insbesondere bei Kleinkindern problematisch sein kann.

Massenspektrometrie (MS): Die derzeit zuverlässigsten Methoden für die quantitative Bestimmung von Steroidhormonen beruhen auf Verfahren, die die hohe Trennleistung der Chromatographie und die hohe Selektivität und Sensitivität der Massenspektrometrie beziehungsweise Tandemmassenspektrometrie (MS bzw. MS/MS) vereinen. Die Kopplung von Gaschromatographie mit MS (GC–MS) entwickelte sich in den 1980er Jahren zum Goldstandard in der Steroidanalyse2. Aufgrund der aufwändigen Probenvorbereitung ist ihre Anwendbarkeit im klinischen Routinebetrieb allerdings eingeschränkt. Die Flüssigchromatographie-Tandem-MS (LC-MS/MS) bietet hier deutliche Vorteile und konnte sich bereits als neues analytisches Verfahren in den vergangenen Jahren im klinischen Labor etablieren (z.B. therapeutische Medikamentenspiegelmessung)2,4. Neben der hohen Sensitivität und Selektivität hat die LC-MS/MS den Vorteil, mit hohem Durchsatz aus einer einzigen Probe simultan zahlreiche Analyten quantitativ bestimmen zu können.

Analyse von Steroidhormonen
mittels Massenspektrometrie – SteroIDQ® Kit

Das SteroIDQ® Kit der BIOCRATES Life Sciences AG ist das erste auf Massenspektrometrie basierende, gebrauchsfertige, CE-gekennzeichnete in-vitro-Diagnostikum zur Analyse von Steroidhormonen. Der ein validiertes LC-MS/MS-Verfahren nutzende Assay ermöglicht durch die simultane Quantifizierung von bis zu 16 Steroidhormonen (Abb. 1) in humanem Serum die derzeit umfassendste Erhebung des Hormonstatus aus nur einer Blutprobe (500 µL). Das Kit beinhaltet ein validiertes Set an Kalibratoren, Qualitätskontrollmaterialien und interne Standards. Im SteroIDQ® Kit werden Matrixeffekte – eine der wichtigsten Ursachen für zufällige und systematische Fehler direkter Immunoassays 5-7 – durch die Verwendung von stabilisotopen-markierten internen Standards nachweislich gut korrigiert. Die Probenvorbereitung erfolgt im 96-Well-Plattenformat mittels Festphasenextraktion (SPE) und bietet eine deutlich verbesserte Probenaufreinigung im Vergleich zum sonst gängigen Proteinfällungsverfahren. Die SPE-Platte und LC-Säule sind im Kit enthalten. Pro Kit können zwischen 20 und 80 Serumproben analysiert werden. Die Messzeit pro Probenextrakt beträgt 22 Minuten.

Validierung des SteroIDQ® Kits

Methodische Entwicklung und analytische Validierung des SteroIDQ® Kit erfolgten für humanes Serum und für AB Sciex Massenspektrometer der Typen API4000TM bzw. 4000Trap®. Die Adaption und Validierung des Kits für weitere Massenspektrometer-Hersteller ist in der Durchführung. Für die Validierung wurden folgende Parameter betrachtet:

  • analytische Selektivität,
  • Linearität der Kalibriergeraden mit entsprechenden linearen Korrelationskoeffizienten,
  • intra-, inter-batch-, inter-day-Präzision und Richtigkeit
  • Wiederfindungsraten
  • Matrixeffekte und umfangreiche Analyt-Stabilitäten.

Externe Qualitätssicherung des SteroIDQ® Kits im Ringversuch

Die externe Qualitätssicherung hinsichtlich Richtigkeit des SteroIDQ® Kits erfolgt durch eine Teilnahme am Ringversuchsprogramm für „Hormonbestimmungen im Serum“ des Referenzinstituts für Bioanalytik der Deutschen Vereinten Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. (DGKL), das sieben Steroidhormone des SteroIDQ® Kits abdeckt. Die mit dem SteroIDQ® Kit erzielten Analysenergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt.
Das SteroIDQ® Kit ist die bislang einzige LC-MS/MS-basierte Methode im Kitformat, die neben der umfassenden Anzahl an Steroid-hormonen auch Östradiol – ein seit langem bekanntes Sorgenkind der Steroidhormonanalyse1,3,8 – hochpräzise und akkurat analysiert.

Fazit und Ausblick

Das SteroIDQ® Kit (Abb. 3) bietet erstmals die Möglichkeit standardisiert, mittels eines validierten Assays eine Palette von 16 Steroidhormonen gleichzeitig aus einer einzigen Blutserumprobe zu quantifizieren. Ermöglicht wird dies durch Einsatz einer hocheffektiven Probenvorbereitung mittels SPE und eines spezifisch für diese Steroidhormone entwickelten und validierten LC-MS/MS Verfahrens, welche als Analysemethode der Wahl für die Steroidhormone nicht nur im klinischen Anwendungsbereich anzusehen ist – besonders wenn neben hoher Selektivität auch ein hohes Probendurchsatzpotential von Interesse ist. Weiterhin bietet gerade die standardisierte Probenanalyse im Kitformat reproduzierbare und – über alle analytischen LC-MS/MS Plattformen hinweg – hochpräzise und vergleichbare Resultate. Das SteroIDQ® Kit bietet ein standardisiertes Verfahren für eine Fülle von medizinisch-endokrinologischen Anwendungsbereichen und Fragestellungen. Es erfüllt alle Kriterien eines CE-gekennzeichneten In-vitro-Diagnostikum gemäß der EU-Richtlinie 98/79/EG und beweist als erstes Medizinprodukt von BIOCRATES deren Kompetenz in der Labordiagnostik.

Literatur

[1]     Stanczyk FZ, Lee JS, Santen RJ. Standardization of steroid hormone assays: why, how, and when? Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2007;16:1713-1719.
[2]     Fanelli F, Belluomo I, Di Lallo VD et al. Serum steroid profiling by isotopic dilution-liquid chromatography-mass spectrometry: comparison with current immunoassays and reference intervals in healthy adults. Steroids 2011;76:244-253.
[3]     Rauh M. Steroid measurement with LC-MS/MS in pediatric endocrinology. Mol Cell Endocrinol 2009;301:272-281.
[4]     Kushnir MM, Rockwood AL, Roberts WL, Yue B, Bergquist J, Meikle AW. Liquid chromatography tandem mass spectrometry for analysis of steroids in clinical laboratories. Clin Biochem 2011;44:77-88.
[5]     Masters AM, Hahnel R. Investigation of sex-hormone binding globulin interference in direct radioimmunoassays for testosterone and estradiol. Clin Chem 1989;35:979-984.
[6]     Bolelli GF, Franceschetti F, Malvano R et al. An interlaboratory study of lipid effects on steroid radioimmunoassay. J Nucl Med Allied Sci 1986;30:209-213.
[7]     Schioler V, Thode J. Six direct radioimmunoassays of estradiol evaluated. Clin Chem 1988;34:949-952.
[8]     Stanczyk FZ, Cho MM, Endres DB, Morrison JL, Patel S, Paulson RJ. Limitations of direct estradiol and testosterone immunoassay kits. Steroids 2003;68:1173-1178

Korrespondenzadresse

Dr. Alexandra C. Gruber, MBA MMFin
Dr. Therese Koal
BIOCRATES Life Sciences AG
Innrain 66/2
6020 Innsbruck
Österreich
Tel: +43-(0)512-579823
Fax: +43-(0)512-823-4270
marketing@biocrates.com
www.biocrates.com

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