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Neue ivD-Plattform für die simultane Messung von bis zu 500 Parametern

In einem Verbundprojekt von sieben Fraunhofer-Instituten wurde ein Lab-on-Chip-System etabliert, welches die patientennahe Diagnostik kostengünstig ermöglicht. Dazu wurde eine kreditkartengroße Kartusche entwickelt, die für einen Assay alle benötigen Reagenzien beinhaltet. Durch Pumpen, die auf dieser Kartusche integriert sind, wird ein Assay wie etwa in einer Mikrotiterplatte prozessiert. Zurzeit ist es möglich, zwischen zwei verschiedenen Sensortypen – einem optischen und einem elektrochemischen – zu wählen Dies qualifiziert das System für eine Vielzahl von biomedizinischen Assays. Dabei ist es durch Microarraytechnik möglich, bis zu 500 verschiedene Analysen simultan durchzuführen. Neben der Kartusche selbst wurde eine Prozessier- und Ausleseeinheit als Basisstation entwickelt. Diese ermöglicht es, anwenderfreundlich einen Assay innerhalb von ca. 15 Minuten ablaufen zu lassen.

Die besondere Herausforderung bei der Konzeption bestand darin, das System auf die simultane Messung von verschiedenen Parametern vorzubereiten, da hier meist verschiedene Konzentrationsbereiche abgedeckt werden müssen. Als Beispiel wird hier die parallele Messung von C-reaktivem Protein (CRP) und dem prostataspezifischen Antigen (PSA) gezeigt. Während CRP im Bereich vom mg/L nachgewiesen werden muss, bewegt sich der medizinisch relevante Bereich für PSA im Bereich von µg/L. Da die hier präsentierte Fraunhofer ivD-Technologie als Plattformtechnologie konzipiert wurde, ist sie offen für verschiedene Assays – auch in anderen Indikationsgebieten. Neben dieser technologischen Seite wurde innerhalb des Projektes auch die Produktion des Systems entwickelt. Dies ermöglicht es, die Kartusche in großen Mengen herzustellen und so direkt Assays im System zu validieren. Durch diese Möglichkeit erübrigt sich der Transfer von einem Demonstrator zum marktfähigen Produkt und macht so die ivD-Plattform neben der Diagnostik auch für Bereiche wie die Biomarkerentwicklung und -validierung oder personalisierter Medizin attraktiv.

Point-of-Care, eines der Schlagwörter des letzten Jahrzehntes, wird nicht mehr nur mit patientennaher Blutzuckermessung in Verbindung gebracht1. Obwohl der Löwenanteil des Marktes immer noch die Blutzuckerbestimmung ist und durch die steigende Tendenz von Diabetes-Erkrankungen in den Schwellenländern bleiben wird, finden sich auf dem Markt einige Systeme, die andere Indikationen wie etwa einen Herzinfarkt nachweisen können2-3. Zusätzlich zeigt sich in der biomedizinischen Forschung, dass bestimmte Diagnosen differenzierter gestellt werden können, wenn nicht nur ein Parameter, sondern direkt eine Vielzahl von Parametern bestimmt und quantifiziert werden4. Dies erfordert neuartige Systeme, die imstande sind, als Plattformtechnologie sehr unterschiedliche diagnostische Anwendungsfelder abzudecken. Forderungen für die Technologie sind (i) eine große Möglichkeit zur Miniaturisierung, (ii) die simultane Messung von verschiedenen Parametern bei zugleich (iii) kostengünstiger Produktion.

Diese Forderungen wurden als Ziel eines Fraunhofer-internen Verbundprojektes formuliert. Unter dem Namen „Fraunhofer ivD-Plattform“ wurde ein System in der Größe einer Kreditkarte entwickelt, welches durch Microarraytechnologie die Messung von bis zu 500 diagnostischen Parametern ermöglicht. Die Fraunhofer ivD-Plattform ist als Plattformtechnologie für eine Vielzahl potentieller Anwendungen angelegt. Da ein integraler Bestandteil der Entwicklung des Systems auch die Produktion betraf, kann das System durch Serienproduktion kostengünstig hergestellt werden.

Das System: Kartusche und Basisstation

Kernelement der Fraunhofer ivD-Plattform ist eine Kartusche in Kreditkartengröße, die sich durch einen hohen Integrationsgrad auszeichnet5. Dabei sind sowohl alle benötigen Reagenzien, Sensoren als auch die Pumpen auf der Kartusche integriert. Somit reicht eine Spannungsquelle zur Prozessierung einer Probe aus. Weiter entfallen gerade durch die Integration der Pumpen fehleranfällige Schnittstellen zur Außenwelt, und eine erhebliche Miniaturisierung des Systems wird ermöglicht6. Um als Plattformtechnologie möglichst viele verschiedene Anwendungsgebiete zu erschließen, zeichnet sich die Kartusche durch einen modularen Aufbau aus, so dass beispielsweise verschiedene Sensoren anwendungsabhängig genutzt werden können. Weiter wird die Kartusche mit allen benötigten Reagenzien bestückt, um anwendungsspezifisch einen Assay durchzuführen zu können.

In der Fraunhofer ivD-Plattform basiert der Nachweis von bestimmten Parametern innerhalb der Probe im Wesentlichen auf einer Bindungsreaktion. Dabei bindet beispielsweise ein Antigen, wie etwa ein Toxin, an einen Antikörper, der in einem Microarray auf einer Oberfläche immobilisiert wurde. Nachdem das Antigen gebunden hat, wird ein Sekundärantikörper mit einer Markierung darüber gegeben, der das Antigen von der gegenüberliegenden Seite binden kann. Der Antikörper kann als Markierung entweder einen Fluoreszenzfarbstoff oder ein Enzymlabel tragen. Im Falle eines Fluoreszenzfarbstoffes kann dieser mittels eines Lasers angeregt und die Fluoreszenz quantifiziert werden. Dies geschieht im System unter Nutzung des Prinzips der „total internal reflectance fluorescence“ (TIRF), wobei durch Einkopplung von Laserlicht in einen Wellenleiter lediglich die oberflächennahe Fluoreszenz gemessen werden kann7. Durch die Verwendung eines Microarrays können so optisch bis zu 500 verschiedene Analysen parallel durchgeführt werden. Die Markierung mittels eines Enzyms wird innerhalb der Fraunhofer ivD-Plattform zum elektrochemischen Nachweis genutzt. Dabei wird ein Substrat vom Enzym umgesetzt, dessen Produkt dann ortsaufgelöst elektrochemisch detektiert wird8. Der hier genutzte Chip bietet die Möglichkeit, 16 verschiedene Analysen simultan zu messen, wobei jedoch durch die Wahl der Messzeit eine Sensitivitätserhöhung möglich ist.

Um einen Assay durchzuführen, wird die Kartusche in eine Basisstation eingelegt. Diese Basisstation enthält neben den Kontakten für die Kartusche im Wesentlichen die Bestandteile, die für den jeweiligen Sensor erforderlich sind. So beinhaltet die Basisstation für die optische Detektion eine Laserdiode zur Anregung, eine CCD-Kamera zum Auslesen und optische Bauteile etwa zur Fokussierung des Anregungslichtes. Durch ein Software-Interface kann dann der Benutzer den Status der Prozessierung verfolgen und erhält nach kurzer Zeit die Ergebnisse der Analyse.

Simultane Bestimmung von verschiedenen Konzentrationsbereichen

Beim Transfer von Assays in das Lab-on-Chip-System müssen verschiedene standardisierte Prozesse durchlaufen werden. Beginnend von der Immobilisierung der Bindungsantikörper, Oberflächenmodifizierung zur Verringerung des Hintergrundes bis hin zum Nachweis der Kreuzreaktivität der Antikörper gegenüber den simultan zu bestimmenden Parametern. Zusätzlich ist eine Optimierung der Prozesse auf dem Chip wichtig. Dabei werden bei der Optimierung Pumpraten, Inkubationszeiten und Waschzyklen auf den Assay abgestimmt. Es ist somit möglich, die klinisch geforderten Bereiche für einen Parameter in geringer Zeit zu realisieren. Bei einem Multiparameterassay ist weiterhin eine besondere Herausforderung, verschiedene Konzentrationsbereiche im gleichen Assay darzustellen. Daher wurde geräte- und softwaretechnisch das System so entwickelt, dass über die Messzeit und anschließende Normierung der Werte es möglich ist, die beiden Konzentrationsbereiche zu erfassen.

Um an einem Beispiel die einzelnen Schritte zu zeigen, wurden zwei Parameter auf die Kartusche adaptiert, deren medizinisch relevanter Bereich um drei Größenordnungen verschieden ist. Es wurden als Biomarker der Entzündungsmarker CRP und der Krebsmarker PSA genutzt. Während der medizinische Schwellenwert für CRP rund 10 µg/L beträgt, liegt der klinisch relevante Bereich für PSA bei 2,5 µg/L. In diesem Fall wurde das Protokoll zur Prozessierung so optimiert, dass der Assay innerhalb von 15 Minuten stattfindet. Es konnte gezeigt werden, dass beide Parameter im klinisch relevanten Bereich nachzuweisen sind. 

Plattformtechnologie nicht nur für die Diagnostik

Die Fraunhofer ivD-Plattform stellt sich als Plattformtechnologie für verschiedenste Anwendungen dar. So kann das System Anwendungen im medizinischen Bereich abdecken. Dabei ist die Anwendung in der Diagnostik am Point-of-Need wie etwa in der Intensiv- oder Notfallmedizin sicherlich naheliegend. Weiter gefasst jedoch kann beispielsweise durch die kostengünstige Produktion des Systems auch dichter gestaffelte Diagnostik angewendet werden, zum Beispiel um die Wirksamkeit einer Therapie zu verfolgen und gegebenenfalls Medikationen direkter an die Resultate anzugleichen. Auch in der biomedizinischen Forschung, etwa bei der Validierung von Biomarkern, kann die Fraunhofer ivD-Plattform genutzt werden, da nach erfolgter Validierung das System direkt als Produkt kommerzialisiert werden kann. Neben der medizinischen Diagnostik sind natürlich auch andere Bereiche wie etwa Umweltschutz, Lebensmittelkontrolle oder Landwirtschaft Anwendungsgebiete, die von der Fraunhofer ivD-Plattform profitieren können. Ziel künftiger Arbeiten wird es sein, eine Vielzahl von verschiedenen Anwendungsgebieten mit Partnern zu erschließen, um somit die Fraunhofer ivD-Plattform für verschiedene Marktsegmente zu qualifizieren. Durch die Möglichkeit zur Produktion der Kartuschen können nach erfolgter Validierung größere Stückzahlen für die kostengünstige Diagnostik vor-Ort generiert werden.

Projektpartner

Das Projekt „Fraunhofer ivD-Plattform“ ist gefördert im Rahmen der internen Programme der FhG, Fördernummer WISA 819 638. Die beteiligten Partnerinstitute sind: Fraunhofer ENAS, IAP, IBMT, IGB, IPA, IPM und ISIT. Weitere Informationen unter www.ivd-plattform.de.

Literatur

[1]     Newman, J.D., Turner, A.P.F., Biosensors  and Bioelectronics (2005), 2435-2453
[2]     Luppa, P.B., Müller, C., Schlichtiger, A., Schlebusch, H., Trends in Analytical Chemistry (2011), 887-898
[3]     Ehrentreich-Förster, E., Andresen, D., Laboratoriumsmedizin (2009), 157-161
[4]     Bier, F.F., Schumacher, S., Public Health Forum, e21-24
[5]     Nestler, J, Schüeller, M., Morschhauser, A., Otto, T., Gessner, T., Brandenburg, A., Michel, D., Bier F.F., Proc. Smart System integration (2009)
[6]     Nestler, J., Otto, T., Sommer, J.-P., Michel, D., Gessner, T., Bier, F.F., Proc Smart System Integration (2010).
[7]     Brandenburg, A., Curdt, F., Sulz, G., Ebling, F., Nestler, J., Wunderlich, K., Michel, D., Sensors and Actuators B- Chemical (2009), 245-251
[8]     Kraus, S., Kleines, M., Labers, J., Blohm, L., Piechotta, G, Püttmann, C., Barth, S., Nährung J., Nebling, E., Biosensors and Biolelectronics (2007), 1898-1901

Korrespondenzadresse

Dr. Soeren Schumacher
Fraunhofer ivD-Plattform
Fraunhofer Institut für Biomedizinische
Technik (IBMT) – Institutsteil Potsdam-Golm
Am Mühlenberg 13
14476 Potsdam
Tel.: +49-(0)-331-58187-314
Fax: +49-(0)-331-58187-299
Soeren.Schumacher@ibmt.fraunhofer.de
www.ivd-plattform.fraunhofer.de

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Heft 4/2011

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