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Genexpressionsprofiling in einzelnen Leukämiezellen

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine bösartige Erkrankung des blutbildenden Systems. Bei einer Inzidenz von 0,7 pro 100.000 Kindern erkranken in Deutschland jährlich etwa 120 Kinder. Durch verbesserte Therapieprotokolle konnte die Überlebensrate dieser früher fast immer tödlich verlaufenden Erkrankung um mehr als 70% gesteigert werden. Dennoch zählt die AML immer noch zu einer der lebensbedrohlichsten Krebserkrankungen bei Kindern und Jugendlichen.

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine hetererogene Erkrankung mit zahlreichen genetischen und morphologischen Untergruppen. Während einige AML-Subtypen sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen ähnliche biologische Eigenschaften aufweisen, sind insbesondere die Megakaryoblastenleukämie, die monoblastären AML bei Säuglingen und die myeloischen Leukämien bei Kindern mit Trisomie 21 einzigartige Entitäten.

Die aktuelle Therapie erfordert eine intensive, nebenwirkungsreiche Polychemotherapie. Die bessere biologische Charakterisierung der AML im Kindesalter kann durch eine optimierte und individualisierte Therapiestratifizierung sowohl zur risikoadaptierten Therapieintensivierung als auch zur Therapiereduktion beitragen. Essentiell für die Entwicklung zielgerichteter, innovativer Substanzen ist die umfassende Aufklärung der Pathomechanismen.

Von großer Bedeutung ist dabei die Identifizierung der Leukämie-induzierenden Stammzellen. Obwohl die Eigenschaften von Tumorstammzellen zunehmend besser untersucht sind und die infragekommenden Populationen weiter eingegrenzt werden, steht die vollständige Differenzierung zwischen präleukämischen, leukämischen Stammzellen und späteren leukämischen Progenitoren aus.

Bei den AML galt die CD34+/CD38-Subpopulation als diejenige Fraktion, in der sich die leukämische Stammzelle (LSC) bzw. die Leukämie-initiierende Zelle (LIC) befinden soll.

Single Cell-Analyse

Aktuelle Untersuchungen weisen allerdings auch darauf hin, dass LIC auch im CD34+/CD38+ (GMP like)-Kompartiment vorhanden sind. Um dieses in primären leukämischen Blasten zu analysieren, könnte die Subgruppe der AML mit Nukleophosmin (NPM1)-Mutation und gleichzeitiger FLT3-interner Tandemduplikation (ITD) hilfreich sein. Man kann  davon ausgehen, dass die NPM1-Mutation in der LIC vorhanden ist, während die FLT3-ITD wahrscheinlich erst in Subpopulationen evident sind. Um dieses eindeutig nachweisen zu können, ist die Analyse der einzelnen Zelle erforderlich. In Kooperation mit Beckman Coulter werden im Rahmen eines umfassenderen Projektes einzelne Leukämiezellen sortiert. Anschließend wird der Expressionsstatus verschiedener Zielgene identifiziert. 

Die sortierten Zellen werden hierzu einzeln auf Objektträgern abgelegt. Auf diesen Objektträgern mit 48 Positionen kann aufgrund der spezifischen Beschaffenheit der Oberflächen im Anschluss mit einer speziellen Chemie sowohl die cDNA-Synthese als auch eine Multiplex-PCR erfolgen. Mit dieser einmaligen Single Cell RT-PCR-Chemie wird vor allem ein ansonsten vielfach notwendiger Schritt der Zwischenamplifikation vermieden. Solch ein Schritt kann immer eine unerwünschte Verfälschung des Originalzustandes in der Zelle mit sich bringen. Die in der Multiplex-PCR gewonnenen Produkte werden aufgrund unterschiedlicher Größen mittels Kapillarelektrophorese im Gene eXpression Profiling (GeXP)-Verfahren aufgetrennt. Aufgrund einer weitestgehenden Automatisierung des Arbeitsablaufs und der Multiplex-PCR können Variationen in den Ergebnissen durch menschliche Fehler minimiert werden (Abb. 1).

Neben den erhaltenen Expressionsprofilen beinhaltet die Technik auch die Möglichkeit, Veränderungen auf DNA-Ebene, wie Insertionen oder Deletionen im Bereich der PCR-Produkte, spezifisch zu erkennen. AML-typische NPM1-Mutationen in Kombination mit FLT3-intenen Tandem-Duplikationen ermöglichen die Validierung des Verfahrens in der Einzelzelle. Die exakte Identifikation und Charakterisierung von Tumorstammzellen ist die Voraussetzung für die Entwicklung LSC-spezifischer Therapieansätze sowie für ein valides Monitoring der minimalen Resterkrankung während und nach der Therapie.

Autoren

Dr. Nils von Neuhoff, Institut für Zell und Molekularpathologie1,Petra Hartmann2 , Dr. Manfred Souquet2, Prof. Dr. Dirk Reinhardt, Kinderheilkunde, Pädiatrische Hämatologie und Onkologie3;1,3 Medizinische Hochschule Hannover; 2Beckman Coulter GmbH, Krefeld

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Heft 4/2011

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