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EHEC-Ausbruch 2011: Next Generation Sequencing von Bakterien in Echtzeit

Wissenschaftler der Medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität (WWU) Münster waren in Kooperation mit der Life Technologies Corp. die Ersten, die am 3. Juni 2011 eine Genomsequenz des EHEC-Isolats O104:H4 des Mitte Mai 2011 begonnenen deutschen Ausbruchs öffentlich zugänglich machten. Die publizierte erstmalige Anwendung einer Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) ist zugleich die erste Quasi-Echtzeitsequenzierung eines bakteriellen Genoms. Dies läutet den Beginn einer neuen Disziplin ein: der prospektiven genomischen Epidemiologie. Kleine, günstige und schnelle ‚Next Generation Sequencing’-Systeme könnten in Kürze große Verbreitung in der Routinediagnostik im Gesundheitssystem und in der klinischen Mikrobiologie finden.

LABORWELT:
Welche Perspektiven eröffnet Ihr Paper?

Harmsen:
Schon bei der genomischen Analyse des EHEC-Ausbruchs 2011 in Deutschland waren wir ex-trem schnell. Es war weltweit die erste publizierte Anwendung des Next Generation Sequencings (NGS) im Rahmen eines Ausbruchsgeschehens nahezu in Echtzeit. Unsere Studie ist daher quasi die Geburtsstunde einer neuen Disziplin, nämlich der prospektiven genomischen Epidemiologie. Diese hat großes Potential, die klassische Epidemiologie künftig zu ergänzen, wie jüngste Arbeiten zeigen. Zuletzt berichteten wir über die Echtzeitsequenzierung multi-resistenter Klebsiella OXA-48-Isolate in Kooperation mit der Nationalen Niederländischen Gesundheitsbehörde RIVM. Die Ergebnisse bildeten unmittelbar die Grundlage für die Entwicklung eines spezifischen Testes. Das war das erste Mal, dass die Genomforschung sozusagen in Echtzeit in der medizinischen Diagnostik ankam. Niederländische Krankenhäuser nutzen bereits diesen Test zum Screening von Neuaufnahmen, um Ausbruchsketten zu beenden und damit präventiv weitere Infektionen zu verhindern.

LABORWELT:
Worin liegen aus Ihrer Sicht methodische Stärken, wo Limitationen des genutzten Sequenzierungsansatzes auf der Personal Genome Machine von Ion Torrent?

Harmsen:
Im Vergleich zu den seit 2005 am Markt etablierten „großen“ und teuren Hochdurchsatz-Systemen wie GS FLX (Roche/454 Life Sciences), Illumina HiScan und ABI SOLiD gehört der PGM zu einer neuen Klasse von Geräten mit geringerem Durchsatz. Diese kleinen „Desktop-NGS“-Maschinen, wie der GS Junior (454/Roche), Ion Torrent PGM oder Illumina MiSeq, sind günstig in der Anschaffung und liefern Ergebnisse in ein bis zwei Tagen. Gerade bei einem Ausbruch ist Geschwindigkeit natürlich Trumpf. Das aktuell am Markt eingeführte Gerät von Pacific Biosciences ist ebenfalls extrem schnell, da kein Amplifizierungsschritt benötigt wird. Es ist jedoch von den Investitionskosten eher mit den großen und etablierten Systemen zu vergleichen und ist daher – anders als die Desktop-Lösungen – nicht für kleine und mittelgroße Laboratorien erschwinglich.

Zu den technologischen Unterschieden: Sowohl der 454 Junior als auch der PGM nutzen die Pyrosequenzierungsmethode – wenig überraschend: Wurden doch beide Systeme von Jonathan Rothberg erfunden und kommerzialisiert. Systemimmanent bei dem Pyrosequenzierung sind InDels durch Probleme bei der Sequenzierung von Homopolymer-Regionen. Diese Art von Fehlern findet sich kaum bei der Illumina-Technik, jedoch sind hier häufiger Substitutionsfehler zu beobachten. 

Charakteristisch für die Pyrosequenzierung sind ferner im Vergleich zu Illumina- und SOLiD-Geräten längere Leseweiten (GS Junior 400 Basen bzw. PGM momentan 200 Basen). Das Besondere am PGM ist jedoch, dass die Detektion der Sequenzierprodukte nicht fluores-zenzbasiert – wie bei allen anderen NGS- Plattformen – sondern mittels eines Semikonduktors pH-basiert ist. Hierdurch ergeben sich schon jetzt manifeste praktische – und auch theoretisch – Vorteile, welche noch in die Praxis translatiert werden müssen. So können durch das Weglassen von Fluoreszenzfarbstoffen sowohl günstigere Geräte – ohne optische Detektionseinheit – als auch niedrigere Verbrauchsmittelkosten erzielt werden. Auch entfällt die sehr Speicher- und CPU-intensive Bildbearbeitung nach der Generierung der Rohdaten. Schließlich ist seit der Markteinführung des PGMs Anfang dieses Jahres eine rasante Fortentwicklung der Plattform zu beobachten – mit einem noch nicht absehbaren Ende.

LABORWELT:
Was sind die nächsten Schritte auf diesem spannenden Weg?

Harmsen:
Perspektivisch arbeiten wir an der Optimierung der nachgeschalteten bioinformatischen Analyse der NGS-Daten. Konkreter: Wir wollen diese Daten in Koppelung mit Geo-Informations-Systemen (GIS) und Raum-Zeit-Clusteranalysen für Ausbruchs-Frühwarnsysteme nutzen. Längerfristig haben wir die Vision, aus den Daten mittels Expertensystemen einen ein- bis zweiseitigen umgangssprachlichen Bericht für Ärzte und/oder Epidemiologen zu erstellen.

Zum Paper 

PLoS One doi:10.1371/journal.pone.0022751
Prospective genomic characterization of the German enterohemorrhagic Escherichia coli O104:H4 outbreak by rapid next generation sequencing technology
,
Alexander Mellmann*, Dag Harmsen*+, Craig A. Cummings*, Emily B. Zentz, Shana R. Leopold, Alain Rico, Karola Prior, Rafael Szczepanowski, Yongmei Ji, Wenlan Zhang, Stephen F. McLaughlin, John K. Henkhaus, Benjamin Leopold, Martina Bielaszewska, Rita Prager, Pius M. Brzoska, Richard L. Moore, Simone Guenther, Jonathan M. Rothberg, Helge Karch.
(+korrespondierer Autor, *Hauptautoren)

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Heft 4/2011

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