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Blitzlicht

Proteinquantifizierung in Zellkulturüberständen

Die Entwicklung biopharmazeutischer Arzneimittel erfordert eine leistungsstarke Analytik zur Bestimmung des Proteingehalts und der Proteinqualität. Insbesondere die Zellkulturentwicklung profitiert von robusten und schnellen Assays zur Bestimmung der Konzentration und der Aktivität von Proteinen aus nicht aufbereiteten Zellkulturüberständen. Zunehmend häufiger werden daher konventionelle Technologien durch labelfreie Echtzeit-Bindungsassays ersetzt.

Die HPLC gilt als klassische Methode der Proteinquantifizierung. Sie wird im Rahmen von Screenings ebenso eingesetzt wie zur Auswertung von Scale-up-Experimenten mit Mikrotiterplatten, T-Flaschen, Schüttelkolben oder Bioreaktoren im Maßstab mehrerer Liter. Die aufwendige Probenvorbereitung und der geringe Durchsatz als Folge der langen Laufzeiten lassen zahlreiche Anwender allerdings verstärkt nach einer HPLC-Alternative mit höherem Durchsatz suchen, die ebenso genaue und verlässliche Ergebnisse mit weniger Aufwand in kürzerer Zeit bereitstellt.

Die BioLayer-Interferometrie (BLI) ist in der Lage Proteine in Zellkulturüberständen ohne umfangreiche Probenvorbereitung zu messen1, 2. Sie basiert auf der Überlagerung von Lichtwellen, die an zwei Grenzflächen in einem Glasfaser-Biosensor reflektiert werden, und der daraus resultierenden Interferenz. Ein High-Throughput Octet®-System analysiert 96 Proben in 15 Minuten, wobei der Einsatz von Robotersystemen vollständig automatisierte Arbeitsabläufe mit deutlich verringertem Personalaufwand ermöglicht (Abb. 1). Ein analoges HPLC-Protokoll nimmt dagegen deutlich mehr Zeit in Anspruch. Es kann einen ganzen Arbeitstag umfassen.

Analyse ohne aufwendige Probenvorbereitung

Am Beispiel eines Fc-Fusionsproteins soll das Potential der BLI-Technologie als Alternative zur HPLC betrachtet werden3. Aufgrund ihrer hohen Selektivität wurden Protein A- und Protein G-Biosensoren zur Bestimmung des Zielproteins in Zellkulturüberständen ausgewählt. In der Assayentwicklung wurde zunächst das gereinigte Protein schrittweise verdünnt und eine Konzentrationsreihe (0 bis 100 µg/ml) in Zellkulturmedium zur Aufnahme von Standardkurven erzeugt.

Alle Assays erfolgten in Mehrfachläufen mit Messungen aus unterschiedlichen Kammern einer 96-Well-Mikrotiterplatte. Der durchschnittliche Variationskoeffizient (Coefficient of Variation, CV) lag unter 9% über den gesamten Standardkurvenbereich. Der dynamische Bereich, der eine hohe Wiederfindung der Standards und einen kleinen Variationskoeffizienten garantiert, wurde mit 1 bis 100 µg/ml ermittelt. Die Ergebnisse belegen die hohe Konsistenz der Messergebnisse über die gesamte Mikrotiterplatte.

Die Experimente umfassten die Untersuchung von Standards bekannter Konzen­tration in verschiedenen Verdünnungen des Zellkulturmediums: ohne Verdünnung (100% Medium), 2-fache Verdünnung (50%), 4-fache Verdünnung (25%) und 8-fache Verdünnung (12,5%). Die aufgestockten Standards konnten mit hoher und vergleichbarer Wiederfindung zurückgewonnen werden. Die Gesamtvariabilität über alle vier Standardkurven (CV < 8%) belegt, dass der Assay mit nicht verdünntem Zellkulturmedium vollständig kompatibel ist (Abb. 2).

Genauigkeit und Verdünnungslinearität

Die Genauigkeit des Octet-Assays wurde durch Quantifizierung des Fc-Fusionsproteins in verschiedenen Konzentrationsbereichen (10 µg/ml, 40 µg/ml und 80 µg/ml) sowohl in reinem Zellkulturmedium als auch in einer Matrix mit Wirtszellprotein (Host Cell Protein, HCP) bewertet. Die Wiederfindung der Standards in nicht verdünntem Zellkulturmedium lag bei 95%, 104% und 109% für die unteren, mittleren und oberen Kontrollen. Die Wiederfindung der Standards in nicht verdünnter HCP-Matrix lag bei inakzeptablen 122%, während in zweifacher, vierfacher und achtfacher Verdünnung Werte um 100% ermittelt wurden. Aus diesem Grund erfolgte für alle weiteren Experimente eine zweifache Verdünnung.

Zur Bestätigung der Verdünnungslinearität, die für jeden Assay von Bedeutung ist, der zum Probenscreening über einen breiten Proteinkonzentrationsbereich eingesetzt wird, wurden Proben des Fc-Fusionsproteins in geringer, mittlerer und hoher Konzentration um einen Faktor 5, 10, 20, 80 und 160 verdünnt und in Mehrfachmessungen analysiert. Der Variationskoeffizient der zurückgerechneten Werte für die Probe mit geringer Konzentration lag bei CV < 7%, für die Proben mit mittlerer und hoher Konzentration bei CV < 5%. Die Ergebnisse dokumentieren die hohe Verdünnungslinearität und die hohen Wiederfindungsraten für das im Zellkultur­überstand gemessene Fc-Fusionsprotein.

Korrelation zwischen BLI und HPLC

Die Evaluation des BLI-Assays als Ergänzung oder Ersatz bestehender HPLC-Protokolle erfordert die Durchführung von Vergleichsstudien. Hierfür wurden 15 Proben analysiert, wobei die ermittelten Proteintiter eine große Übereinstimmung zwischen beiden Techniken bestätigten (Abweichung unter 10% für die Mehrzahl der Proben). Die BLI-Analyse mit dem Octet-System benötigte weniger als 15 Minuten, während die HPLC-Analyse etwa drei Stunden in Anspruch nahm (Abb. 3). Die Durchführung einer Studie mit mehreren Operatoren, die ihre Messungen über einen Zeitraum von mehreren Tagen durchführten, zeigte eine hohe Übereinstimmung der Ergebnisse (CV < 5 %, n = 54; vgl. Abb. 4) und bestätigte die hohe Genauigkeit der BLI-Assays.

Schlussfolgerung

Moderne BLI-Assays ermöglichen eine schnelle und verlässliche High-Throughput-Proteinquantifizierung in Zellkulturüberständen. Sie benötigen keine arbeitsintensive und zeitaufwendige Probenvorbereitung und bieten damit gegenüber der klassischen Analyse mittels HPLC wichtige Vorteile. Alle BLI-Systeme sind zudem einfach zu bedienen, so dass lange Einarbeitungszeiten aufgrund aufwendiger Operator-Schulungen entfallen.

Literatur

[1] Wünsche H und Sievers D. Quantifizierung monoklonaler Antikörper – Biolayer-Interferometrie. GIT-Laborfachzeitschrift 57 (3) 2013: 176-178.
[2] Takkar R. Enhancing Efficiency and Economics in Process Development and Manufacturing of Biotherapeutics. Bioprocess International Industry Yearbook 11 (7) 2013: 119-121.
[3] Takkar R et al. Rapid, Reliable Quantitation of Fc-Fusion Protein in Cell Culture Supernatants. Application Note 13, Pall Life Sciences, ForteBio Division, Menlo Park, CA, 2013; www.fortebio.com/documents/ForteBio_App_Note_13.pdf

Korrespondenzadressen

Dr. Hendrik Wünsche
Field Applications Specialist
hendrik_wuensche[at]europe.pall.com
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Technical Marketing Manager
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